[发明专利]一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒及其应用。本发明在PCR反应中同时扩增SMN基因外显子、SMN2修饰因子、SMN1微小致病变异与分子遗传标记，通过毛细管电泳分析PCR产物以SMN基因皆为2拷贝数的SMA正常对照进行计算，对SMN1和SMN2基因第7、8外显子拷贝数进行相对定量的检测，计算出0、1、2、3、≧4拷贝数的SMN基因，区分SMN基因外显子拷贝数正常、杂合与纯合缺失突变，可提示SMN2转录子增加、SMN1具有微小致病变异，并提供家系分析需要的信息，明确SMN1基因遗传途径。从DNA样本开始，2.5小时内可以出结果，只需要一次PCR实验即可实现覆盖SMA所有遗传变异方式的辅助诊断，检测技术流程简单，容易实现标准化。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种整合SMN1与SMN2拷贝数、微小变异与家系连锁分析的试剂盒及其应用。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一种由于脊髓前角及延髓运动神经元变性导致近端肢体和躯干进行性对称性肌无力和肌萎缩的常染色体隐性遗传病，因位于染色体5q11.2-q13.3上的运动神经元存活基因1(survival motor neuron 1,SMN1)缺失或突变致使运动神经元存活蛋白(survival motor neuron protein,SMN)表达降低而致病，位居2岁以下致死性遗传病首位。SMA在存活新生儿中的发病率约1/6000～1/10000，但中国人群携带率高达1/42，2018年已被列入我国《第一批罕见病目录》。

SMA为单基因遗传病，但其遗传变异方式非常多样，约95％患者存在SMN1第7号外显子和/或第8号外显子纯合缺失，即SMN1拷贝数为0，另有5％为SMN1点突变复合等位基因缺失所致的复合杂合突变单拷贝患者，均可影响全长mRNA转录导致体内SMN蛋白水平降低而致病。目前国内已报导的微小致病性变异中检测频次≧2，且经美国遗传与基因组学学会(ACMG)致病性评估确认是致病性微小变异有共7种，包括c.22dupA、c.683TA、c.689CT、c.863GT、c.400GA、c.463_464delAA、c.835-5TG。

再者，就SMA携带者而言，除SMN1“1+0”型的常见基因型外，仍有近8％包括SMN1“2+0”型、SMN1“1+1^d”型在内的隐形携带者，此类携带者的SMN1拷贝数≥2，与正常人完全相同，给遗传咨询带来诸多复杂性。基于25％的常染色体隐性遗传再发概率及中国人群的高携带率，如不及时给予精准诊断，全国每年将不可避免增加至少5000名新发患儿，给社会带来沉重负担。

SMN2为SMN1的高度同源基因，两者仅5个碱基差异，但因SMN2第7号外显子c.840CT突变可破坏剪接增强子结构导致SMN2外显子7跳跃，进而编码出易被降解的不稳定截短蛋白(SMNΔ7)，最后仅表达少量功能性SMN蛋白维持生理功能。作为SMA疾病进程的最重要生物标志物，SMN2拷贝数与疾病严重程度呈负相关，拷贝数越高，疾病表型相对越轻。同時有研究发现一些携带2个SMN2拷贝数的SMA患者并不是严重的1型而是更轻的2型或者3型，进一步分析发现这些患者SMN2上存在罕见的多态性变异(c.859GC、c.835-44AG等)，经功能实验证实这些变异可导致含外显子7的全长转录本增加，SMN蛋白水平提升从而缓解疾病进展及预后。因此，SMN1与SMN2均为SMA遗传学检测的要素，一次性实现SMN1与SMN2的精准检测对患者诊断与预后十分重要，更对携带者及整个家系的遗传咨询具有重要意义。