[发明专利]干血斑中25-羟基维生素D的干血斑提取仪串联LC-MS/MS检测方法

说明书

本发明属于医学生物检测技术领域，具体涉及干血斑中25‑羟基维生素D的干血斑提取仪串联LC‑MS/MS检测方法。本发明通过全自动干血斑提取仪串联LC‑MS/MS分析系统来分析干血斑中25‑羟基维生素D的含量，仪器自动化程度高，无需复杂的人工处理样本，不仅可以降低人力物力成本，提高分析效率，而且有效避免了人为因素影响，检测数据更加准确可靠，具有很好的具有很好的专属性、线性、准确度、精密度、灵敏度，整个检测过程仅需5分钟，为干血斑的25‑羟基维生素D检测技术在临床及临床试验领域的应用提供了可能性。

技术领域

本发明属于医学生物检测技术领域，具体干血斑中25-羟基维生素D的干血斑提取仪串联LC-MS/MS检测方法。

背景技术

维生素D是人体内一种重要的调节因子，除参与人体内钙磷代谢，其还与心血管疾病、高血压、免疫疾病、肿瘤及糖尿病等疾病密切相关。25-羟基维生素D是衡量维生素D营养状态的最佳指标，是维生素D在人体内的主要存在形式，其性质稳定，能充分反应食物摄入与自身合成的维生素D总量。

当前已有多种商业化及实验室自行开发的方法用于25-羟基维生素D的常规检测，包括蛋白结合法、放射免疫法、自动化学发光法、ELISA法及LC-MS/MS法。其中，LC-MS/MS法以其高灵敏度和高选择性的特点被广泛运用。

申请公布号为CN113640428A的文件公开了一种通过高效液相色谱与质谱联用检测样品中25-羟基维生素D的方法。但是该检测方法有以下不足：1.干血斑在进LC-MS/MS分析之前需要经过较为复杂的前处理过程，包括手工打孔、溶液萃取、离心、转移至进样瓶等多个步骤，耗时较长；2.干血斑中25-羟基维生素D含量较低，基质复杂；3.干血斑样品检测通量小，分析效率较低，成本较高。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明的目的是提供干血斑中25-羟基维生素D的干血斑提取仪串联LC-MS/MS检测方法，通过全自动干血斑提取仪串联LC-MS/MS分析系统来分析干血斑中25-羟基维生素D的含量，仪器自动化程度高，无需复杂的人工处理样本，不仅可以降低人力物力成本，提高分析效率，而且有效避免了人为因素影响，检测数据更加准确可靠，具有很好的具有很好的专属性、线性、准确度、精密度、灵敏度，整个检测过程仅需5分钟，为干血斑的25-羟基维生素D检测技术在临床及临床试验领域的应用提供了可能性。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

干血斑中25-羟基维生素D的干血斑提取仪串联LC-MS/MS检测方法，包括以下步骤：

步骤1、干血斑提取仪在线提取

提取：干血斑自动进样器固定干血斑卡片，然后对干血斑添加经定量环吸取的含内标的萃取液，得到提取液；

上样：提取液上样至活化的在线固相萃取柱进行富集和净化；

步骤2、LC-MS/MS洗脱及检测

洗脱：采用二元泵将流动相液体对在线固相萃取柱进行洗脱，得到洗脱液；

检测：洗脱液进样到LC-MS/MS中对其进行定量检测。

作为本发明的进一步优选，步骤1提取中所述含内标的萃取液先经加热模块预热至40～60℃，再添加至干血斑处。采用预热模块将萃取液加热到40～60℃范围内可以促进提高干血斑中25-羟基维生素D的提取回收率；更进一步地，优选为50℃。

作为本发明的进一步优选，步骤1提取中采用高压分配器将甲酸溶液与所述含内标的萃取液一起添加至干血斑处进行提取，所述甲酸溶液的浓度为0.05～0.15％。

作为本发明的进一步优选，步骤1提取的处理条件为：流速1.5～2.5ml/min，时间0.1～1.0min。

作为本发明的进一步优选，步骤2中液相色谱条件如下：