[发明专利]肌氨酸氧化酶的制备方法和应用

说明书

本申请公开了一种肌氨酸氧化酶的制备方法和应用。本申请中提供的芽孢杆菌属肌氨酸氧化酶优化密码子，相比其他菌属肌氨酸氧化酶或者芽孢杆菌属肌氨酸氧化酶经不同优化方式得到的优化密码子，在大肠杆菌中表达可溶蛋白量高，且表达产物酶活高；本申请中提供的原核表达体系的肌氨酸氧化酶表达方法，收率高，纯化步骤简单，适宜工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及肌氨酸氧化酶的制备方法和应用。

背景技术

肌氨酸氧化酶(Sarcosine oxidase,EC.1.5.3.1,SOX)属于黄素蛋白氧化酶类，以FAD为辅因子，不同来源的肌氨酸氧化酶结构存在一定差异，根据亚基数不同，肌氨酸氧化酶可以分为单聚体、二聚体和四聚体。单聚体肌氨酸氧化酶是氨基氧化酶家族的典型成员，单聚体肌氨酸氧化酶的结构性质较为相似，一般与FAD共价结合，相对分子量为40kDa左右。

肌氨酸氧化酶是酶法测定肌酐中的关键酶，可催化肌氨酸中的N-甲基的氧化还原，可偶联肌酐酶和肌酸酶将肌酐降解。目前，临床检测肌酐的方法利用前述反应机理，检测血清或尿液中肌酐的含量，而血清或尿液中肌酐的含量可反应肾脏的排泄功能，是判断肾功能的一项重要指标。肌氨酸氧化酶作为一种诊断酶试剂，现已广泛应用于医疗诊断领域。

目前用于制备肌氨酸氧化酶的方法是野生菌肌氨酸氧化酶提取法，提取的肌氨酸氧化酶纯化步骤极为繁琐，多为多种常规分离方法的组合。Hassan-Abdallah等研究者曾经采用凝胶过滤层析、阴离子交换层析和疏水层析分离和纯化假单胞菌属(Pseudomonasmaltophilia DSM2701)肌氨酸氧化酶，纯化后产物比酶活仅为9.8U/mg。由此可见，常规的微生物提取分离法制备肌氨酸氧化酶不仅步骤繁琐而且酶活回收率低，难以满足工业规模化生产的需要。

此外，部分专利中公开了通过重组蛋白法制备肌氨酸氧化酶的方法，具体包括改造全基因合成人源化肌氨酸氧化酶编码的基因序列，将改造后的肌氨酸氧化酶编码基因序列插入表达载体中，并用大肠杆菌菌株转化表达：将转化表达菌株接种于LB培养基，IPTG诱导：所得菌体破菌，离心分离，过Ni-NTA柱纯化，得到重组肌氨酸氧化酶。但该专利中公开的方法得到的表达产量较低，产物酶活偏低(仅有30U/ml)。因此，本领域尚需开发一种高产量的产物活性高的肌氨酸氧化酶制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肌氨酸氧化酶的制备方法。

本发明的另一目的在于提供编码肌氨酸氧化酶的多核苷酸序列。

本发明的另一目的在于提供与编码肌氨酸氧化酶的多核苷酸序列适配的载体。

本发明的另一目的在于提供含有编码肌氨酸氧化酶的多核苷酸序列的试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明第一方面，提供了一种编码肌氨酸氧化酶的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

(i)如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；

(ii)与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

(iii)与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

本发明第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。

本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者

所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。