[发明专利]一种可用于核酸检测的耐高温反转录酶及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种可用于核酸检测的耐高温反转录酶及其制备方法与应用。本发明通过对反转录酶基因进行了随机突变，并进行高热稳定性反转录酶的筛选，最终成功筛选得到一种耐高温M‑MLV反转录酶突变体M‑MLV‑M3，其氨基酸序列如序列8所示。相比天然M‑MLV和商业耐高温M‑MLV反转录酶，M‑MLV‑M3具有更好的热稳定性，在65℃下依然具有良好的反转录酶活性，其可以用于常规的反转录反应，同时还可以用于荧光PCR的检测，尤其适用于高GC含量或复杂结构的RNA模板。本发明通过优化改造反转录酶有效提升了反转录酶的热稳定性及反转录酶产品的性能，尤其提升了对于复杂结构RNA的研究和核酸检测水平。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可用于核酸检测的耐高温反转录酶及其制备方法与应用。

背景技术

反转录酶属于DNA聚合酶的一个亚家族，具有RNA依赖性DNA聚合酶和RNase H活性，能够以RNA为模板合成DNA。反转录酶是当前应用最为广泛的一种工具酶，它介导的反转录反应将mRNA 转化为cDNA是许多基因表达研究中必不可少的步骤，几乎所有与RNA相关的研究和临床方案都离不开它。它也是核酸检测必不可少的原料，反转录酶的性能直接决定了核酸检测的效率。最常用的反转录酶分别是来自莫洛尼鼠白血病病毒的M-MLV反转录酶和禽骨髓母细胞瘤病毒的AMV反转录酶。而M-MLV反转录酶相比AMV反转录酶，具有更高的酶活性和更低的生产成本，因此被更多的应用于核酸检测应用。

天然M-MLV反转录酶的性能并不是非常理想，由于天然M-MLV反转录酶的最佳反应温度是37℃，过低的反应温度会导致引物与RNA模板错误结合，从而降低了核酸检测的特异性，造成核酸检测的假阳性结果。而且，针对复杂结构的RNA模板或高GC含量的RNA模板，由于RNA模板会自我聚合形成发夹环二级结构，特定的二级结构可以参与调控复制、转录和翻译，37℃难以打开发夹环二级结构，从而导致引物无法与RNA模板结合启动DNA的合成，造成反转录反应失败，最终导致转录组分析数据出现系统偏差或病毒核酸检测出现假阴性结果。

要解决该问题，需要提升反转录的反应温度，然而研究证明天然M-MLV反转录酶在49℃会迅速不可逆的丧失酶活。为了提升M-MLV反转录酶的热稳定性，国外多个研究机构和企业尝试对M-MLV反转录酶进行改造，主要是通过对M-MLV反转录酶中多个关键氨基酸位点进行改造，并证明了改造后的M-MLV反转录酶热稳定性可以得到提升。然而尽管对于M-MLV反转录酶的改造取得了不错的成绩，目前也仅能将M-MLV反转录酶的耐受温度最高提升到60℃，当前针对RNA相关的科学研究和临床检测依然对于更高耐受温度的M-MLV反转录酶存在需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于核酸检测的耐高温M-MLV反转录酶及其制备方法与应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质为将M-MLV蛋白氨基酸序列的第12位的谷氨酸突变为丝氨酸，且将第53位的赖氨酸突变为谷氨酸，且将第84位的谷氨酰胺突变为精氨酸，且将第383位的谷氨酰胺突变为脯氨酸，且将第464位的亮氨酸突变为谷氨酸，且将第603位的亮氨酸突变为色氨酸，且将第623位的丙氨酸突变为精氨酸，且保持所述M-MLV蛋白其它氨基酸序列不变后得到的蛋白质。所述M-MLV蛋白氨基酸序列如序列表中序列2所示。

上述蛋白质可为如下(a1)-(a3)中任一所述的蛋白质：

(a1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过除第12位、第53位、第84位、第383位、第464位、第603位和第623位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

(a3)将(a1)或(a2)所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。