[发明专利]一种2，4-二羟基丁酸生物合成途径的构建方法及应用

权利要求书

1.一种2，4-二羟基丁酸的制备方法,其特征在于，包含醛缩酶、HOB还原酶为催化酶，以甲醛与丙酮酸为底物，反应生成2，4-二羟基丁酸；

具体地，以混合酶催化反应或分步催化进行反应，所述分步催化反应如下：

1）醛缩酶催化甲醛与丙酮酸生成4-羟基-2-酮-丁酸；

2）HOB还原酶催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2，4-二羟基丁酸。

2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于，进一步包括通过甲醛供体作为最初底物合成甲醛的步骤；优选地，甲醛供体为甲醇、甲酸或肌氨酸，相应地包括甲醇脱氢酶、甲酸脱氢酶、肌氨酸氧化酶，经酶促催化反应生成甲醛；更具体地，按下述反应过程进行：甲醇脱氢酶催化甲醇生成甲醛；肌氨酸氧化酶催化肌氨酸生成甲醛；或甲酸脱氢酶催化甲酸生成甲醛；

进一步也包括通过丙酮酸供体作为最初底物合成丙酮酸步骤，具体地，所述丙酮酸供体是乳酸，相应地包括催化该反应的酶元件，便如乳酸脱氢酶、或基于乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶突变体获得的HOB还原酶（EC:1.1.1.37 ,SEQ ID NO.3）、HOB还原酶（EC:1.1.1.27，SEQ ID NO.4），由乳酸经酶促催化反应生成丙酮酸。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，通过包含反应所需的各种酶的体外多酶体系进行催化合成2，4-二羟基丁酸，或者通过过表达反应所需的各种酶的重组菌株制备的催化体系生物合成2，4-二羟基丁酸。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的醛缩酶是能够以丙酮酸作为供体，甲醛为受体的醛缩酶；具体是I类醛缩酶或II型醛缩酶；更具体为4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶（UniProtKBW0PEX6，SEQ ID NO.2）、4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶（UniProtKBA0A1Y0N802,SEQ ID NO.6）、4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶（UniProtKBA0A7X8PF03, SEQ ID NO.7）、4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶（UniProtKBA0A4S0ZMA9, SEQ ID NO.8）、4-羟基-2-氧代戊酸醛缩酶（UniProtKBA0A254U9J8, SEQ ID NO.9）、2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶（EC: 4.1.3.16）、2-脱氢-3-脱氧-L-鼠李糖酸醛缩酶（EC: 4.1.2.53）和5-酮-4脱氧-D-戊二酸醛缩酶（EC: 4.1.2.20）；

所述HOB还原酶是可有效催化4-羟基-2-酮-丁酸生成2，4-二羟基丁酸的还原酶，具体地是乳酸脱氢酶的突变体，或苹果酸脱氢酶的突变体，具体例子是HOB还原酶（EC:1.1.1.37,SEQ ID NO.3）、HOB还原酶（EC:1.1.1.27，SEQ ID NO.4）；

所述甲醇脱氢酶是吡咯喹啉醌(PQQ)依赖型的甲醇脱氢酶、NAD依赖型的甲醇脱氢酶(EC: 1.1.1.6，SEQ ID NO.1)、或甲醇氧化酶AOX；

所述肌氨酸氧化酶是可催化肌氨酸生成甲醛与甘氨酸，具体是肌氨酸氧化酶（EC:1.5.3.1，SEQ ID NO.5）。