[发明专利]利用大肠杆菌P450酶全细胞催化合成羟基化黄酮化合物的方法及应用

权利要求书

1.细胞色素P450酶突变体，其特征在于，以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为出发序列，进行了如下任意一种改进：

(1)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第88位的精氨酸突变为丙氨酸；

(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第96位的丝氨酸突变为丙氨酸；

(3)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第88位的精氨酸突变为丙氨酸，并将第96位的丝氨酸突变为丙氨酸。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.表达权利要求1所述细胞色素P450酶突变体或表达SEQ ID NO.1所示细胞色素P450酶的重组大肠杆菌。

4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，还表达铁氧还蛋白还原酶基因CamA和铁氧还蛋白基因CamB。

5.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌还表达氧化还原伴侣基因；所述氧化还原伴侣基因包括大肠杆菌的黄素氧还蛋白还原酶Fpr和大肠杆菌来源的黄素氧化蛋白Fld、FldA、FldB、枯草芽孢杆菌来源的黄素氧化蛋白YkuN、YkuP中的任一蛋白的组合。

6.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌使用表达载体共表达权利要求1所述细胞色素P450酶突变体、大肠杆菌来源的黄素氧化蛋白和大肠杆菌来源的黄素氧化蛋白还原酶；所述黄素氧化蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述黄素氧化蛋白还原酶具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述表达载体为pRSFDuet-1。

8.根据权利要求3～7任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括但不限于BL21(DE3)，C41(DE3)或C43(DE3)。

9.一种全细胞催化合成羟基化黄酮化合物的方法，其特征在于，以权利要求3～8任一所述的重组大肠杆菌作为细胞催化剂，在含底物的反应体系中，于20-37℃反应至少1-12h；所述底物包括柚皮素、二氢山奈酚、山奈酚、芹菜素或大豆苷元中的一种或多种。

10.权利要求3～7任一所述的重组大肠杆菌或权利要求9所述方法在生产含一种或多种羟基化黄酮化合物的产品中的应用；所述羟基化黄酮化合物包括：圣草酚、二氢槲皮素、槲皮素、木犀草素或7,3',4'-三羟基异黄酮。