[发明专利]一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒及其应用

说明书

本发明属于分子生物学领域领域，涉及miRNA Let‑7a的检测，特别是指一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let‑7a的试剂盒及其应用。包括以下核苷酸链：A1链、A2链、A3链、AP链和荧光链，磁珠混合液，PBS缓冲液，BSA缓冲液和Cutsmart缓冲液；其中A1链序列如SEQ ID No.1所示、A2链序列如SEQ ID No.2所示、A3链序列如SEQ ID No.3所示、AP链序列如SEQ ID No.4所示、荧光链序列如SEQ ID No.5所示，其3’端修饰有FAM基团。本方法基于磁珠和氧化石墨烯辅助下的无酶放大策略的传感系统机制，可以实现对目标基因高灵敏和高选择性检测。

技术领域

本发明属于分子生物学领域领域，涉及miRNA Let-7a的检测，特别是指一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒及其应用。

背景技术

let-7a是let-7miRNA家族的成员之一，let-7miRNA家族最初在线虫中被发现，是发育过程的主要调节因子，分布在9条不同染色体上。let-7存在多种亚型，由13个成员组成，分别为let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-202和miR-98。该家族所有成员的5′端均具有“种子序列”的高度保守核苷酸序列，即“TGAGGTA”。let-7a已被发现于包括食管鳞状细胞癌、肺癌、鼻咽癌和卵巢癌等大部分人类恶性肿瘤中。let-7a作为let-7miRNA 家族的成员之一，在细胞增殖、凋亡、生长和转移等许多细胞生物学过程中发挥着重要的作用。因此，围绕let-7a基因展开基因检测具有十分重要的意义。

现有的miRNA Let-7a的检测方法并不能精确、灵敏的检测miRNA。已有研究人员通过多种恒温扩增技术，提高核酸检测的灵敏度；专利一种用于QCM检测miRNA Let-7a的试剂盒及方法，通过在QCM的基础上添加信号增强剂进而实现提高检测准确性的目的，该专利属于电化学传感器领域，其检测灵敏度有待提高；专利基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子Let-7a检测试剂盒及其使用方法，为本课题组前期的研究成果，公开了一种在外切酶的帮助下实现对Let-7a检测的试剂盒，由于含酶的检测方法在实际检测中要求的条件比较苛刻；因此，本课题组致力于开发新的不依靠酶作用来实现提高检测miRNA Let-7a灵敏度的目的。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒，包括以下核苷酸链：A1链、A2链、A3链、AP链和荧光链，磁珠混合液，PBS缓冲液，BSA缓冲液和Cutsmart缓冲液；其中A1链序列如SEQ ID No.1所示、A2链序列如SEQ ID No.2所示、A3链序列如SEQ IDNo.3所示、AP链序列如SEQ ID No.4所示、荧光链序列如SEQ ID No.5所示，其3’端修饰有FAM基团。

上述磁珠混合液中的磁珠均为经修饰链霉亲和素后的磁性微珠。

上述PBS缓冲液的浓度为1mM，pH为7.4，BSA缓冲液的浓度为0.4mg/mL，Cutsmart缓冲液的浓度为10 mM。

上述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，步骤为：

（1）配制A1链溶液、A2链溶液和A3链溶液，然后经混匀孵育，得到三链复合底物溶液；

（2）向步骤（1）得到的三链复合底物溶液中加入PBS缓冲液与磁珠混合液，混匀后，震荡条件下孵育至反应完全；

（3）将步骤（2）反应后的磁反应液离心、分离磁珠，取出反应液后，向含有磁珠的反应管内加入BSA缓冲液，震荡条件下孵育至反应完全；