[发明专利]一种外泌体及外泌体RNA串联富集鉴定方法

说明书

本发明公开了一种外泌体及外泌体RNA串联富集鉴定方法。包括如下步骤：将TiOsubgt;2/subgt;微球与生物样本共同孵育以捕获生物样本中的外泌体，清洗去除非特异性吸附，得到表面附着有外泌体的TiOsubgt;2/subgt;微球；加入裂解/结合缓冲液，裂解外泌体使其释放内容物，继续孵育，使外泌体释放的RNA结合到TiOsubgt;2/subgt;上，清洗去除非特异性吸附，完成生物样本中exoRNA的富集，最后加入洗脱液将exoRNA洗脱下来，离心收集上清液即可。本发明操作简单，耗时短、成本低，相较于其他方法具有明显的优势。从外泌体富集，到exoRNA的释放，再到exoRNA的富集，整个过程仅需30min；同时裂解液中包含多种抑制RNase活性的成分，保证得到高质量exoRNA。

技术领域

本发明涉及一种外泌体及外泌体RNA串联富集鉴定方法，涉及生物技术及分析化学领域。

背景技术

核糖核酸(RNA)作为遗传信息的传递者，也是精准药物治疗中有吸引力的靶点。RNA包括编码蛋白的编码RNA(mRNA)和非编码RNA(ncRNA)；ncRNA虽然不编码蛋白质，但调控着生理和发育进程，同时在多种疾病的发生发展中扮演着关键调节因子；因此RNA也成为了潜在的疾病诊断标志物，为疑难杂症提供新的治疗方向。外泌体是由大多数真核细胞分泌的纳米级(30-200nm)细胞外囊泡，包含可以在细胞之间传递和交联的蛋白质、RNA和DNA等生物分子；作为细胞间通信和信号转导的重要中介，在一系列生理和病理过程中发挥关键作用。研究发现，外泌体RNA(exoRNA)种类分布不同于体液，其中仅有少量甚至没有核糖体RNA，但包含大量的mRNA和ncRNA(miRNA、lncRNA等)。由于外泌体的囊泡结构可以保护RNA免受体液中的酶降解，因此，外泌体中各类RNA的含量相对于体液RNA更稳定，浓度更高，它们的病理生理作用正在各种疾病中被解码。有研究表明，exoRNA能够影响肿瘤的发生发展、转移、侵袭及肿瘤微环境，使得exoRNA成为极具应用前景的临床诊断分子标志物。获得质量好、完整性高的RNA是进行RNA下游相关分析和研究的前提。目前，RNA的提取方法主要包括乙醇沉淀法、基于苯酚、基于柱以及基于苯酚和柱组合的方法。这些方法存在提取时间长、步骤繁琐、成本高、有毒性等不足。发展快速、高效、经济绿色的RNA提取方法对于RNA的深度发掘具有重要生物学意义。同时已有研究表明现有的分离方法在exoRNA产量、纯度和大小模式分布方面存在广泛差异，还会影响小RNA的组成比、miRNA的含量和数量等。由于外泌体生物来源样品量少，外泌体含量少，相应exoRNA丰度低，因此exoRNA研究的关键在于外泌体的高效快速富集及RNA的特异性分离富集。基于此，亟需发展新的富集策略。

发明内容

本发明的目的是利用TiO₂-磷酸基团的特异性相互作用，提供一种外泌体及外泌体exoRNA串联富集鉴定的新策略。

本发明通过将TiO₂微球与生物样本共同孵育以捕获其中的外泌体，加入裂解/结合缓冲液裂解外泌体使其释放内容物；释放的RNA进一步结合到TiO₂上，完成体液外泌体及exoRNA的串联富集，最终通过测序技术对富集的RNA进行解析。本发明能够快速高效地从生物样本中共同提取外泌体及exoRNA。

本发明所提供的外泌体及外泌体exoRNA串联富集鉴定方法(流程图1所示)，包括如下步骤：

1)将TiO₂微球与生物样本共同孵育以捕获生物样本中的外泌体，清洗去除非特异性吸附，得到表面附着有外泌体的TiO₂微球；

2)加入裂解/结合缓冲液裂解外泌体使其释放内容物，继续孵育，使外泌体释放的RNA结合到TiO₂上，清洗去除非特异性吸附，完成生物样本中exoRNA的富集，最后加入洗脱液将RNA洗脱下来，离心收集上清液即可进行测序分析。

上述方法步骤1)中，所述生物样本可为血液、尿液、羊水等包含外泌体的样本，具体可为血清；