[发明专利]一种在酵母中异源表达的内切β-1,3-葡聚糖酶、重组菌及应用

权利要求书

1.一种在酵母中异源表达的内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13，其特征在于，所述内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2。

2.如权利要求1所述的在酵母中异源表达的内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13，其特征在于，内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13基因的合成引物包括如SEQ ID NO:3所示的正向引物和如SEQ ID NO:4所示的反向引物。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体能够表达权利要求1所述的内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13。

4.一种基因工程菌，其特征在于，为携带权利要求2所述的重组表达载体的酵母菌。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为酵母菌MF060/pPIC9K/RG.Glu-13，其保藏编号为CCTCC NO：M 20221817。

6.权利要求1所述的在酵母中异源表达的内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13，权利要求3所述的重组表达载体，权利要求4所述的基因工程菌在制备酵母β-葡寡糖中的应用。

7.一种高密度发酵培养内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将单菌落基因工程菌接入YPD培养基中过夜培养，离心，收集菌体，其中，所述基因工程菌为权利要求4所述的基因工程菌；

步骤2：将步骤1所得菌体接入BMGY培养基中培养，离心，收集菌体，其中，培养过程中添加甘油，甘油的添加方式为：BMGY培养基中初始甘油浓度为10％，每次甘油耗尽后，添加量按照10％梯度增长；

步骤3：将步骤2所得菌体接入BMMY培养基中发酵诱导培养，该过程中通过流加甲醇进行诱导；

步骤4：将步骤3所得的发酵液依次经过离心、微滤膜过滤除杂和超滤浓缩后，得到内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13粗酶液。

8.如权利要求7所述的高密度发酵培养内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13的方法，其特征在于，所述步骤3中流加甲醇的方式为：

甲醇诱导过程0-2h，按照2.5‰v/v比例每小时流加100％甲醇；

甲醇诱导过程3-9h，按照3‰v/v比例每小时流加100％甲醇；

甲醇诱导过程9-24h，按照5‰v/v比例每小时流加100％甲醇；

甲醇诱导过程24-30h，按照5.5‰v/v比例每小时流加100％甲醇；

甲醇诱导过程30-96h，按照6‰v/v比例每小时流加100％甲醇。

9.一种通过酶解酵母β-葡聚糖制备酵母β-葡寡糖的方法，其特征在于，利用权利要求8所述的高密度发酵培养内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13的方法获得的内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13粗酶液对酵母β-葡聚糖进行酶解，具体包括：用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配置酵母β-葡聚糖溶液，按照如下反应体系进行酶解：

20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，内切β-1,3-葡聚糖酶RE.Glu-13粗酶液添加比例为10-30％，酵母β-葡聚糖终浓度为30-100g/L；反应体系溶液的pH值为5.2-6.2；反应体系溶液的温度为50-60℃；反应时间为3-30h。