[发明专利]一种提高大肠杆菌鲁棒性的重组菌及其构建方法

权利要求书

1.一种鲁棒性提高的重组大肠杆菌，其特征在于，为引入了非天然膜组分hopanoids的重组大肠杆菌；非天然膜组分hopanoids的合成是通过大肠杆菌內源MEP途径结合引入的外源人工合成途径进行。

2.根据权利要求1所述的鲁棒性提高的重组大肠杆菌，其特征在于，将大肠杆菌中的甲基乙二醛合酶基因mgsA替换为角鲨烯合酶基因tErg9，并运用人工启动子策略上调tErg9的表达；将磷酸乙酰转移酶基因pta替换为角鲨烯-藿烯环化酶基因shc，并运用人工启动子策略上调shc的表达，得到重组工程菌。

3.根据权利要求2所述的鲁棒性提高的重组大肠杆菌，其特征在于，还包括对所得重组工程菌內源MEP途径关键限速酶进行人工调控的步骤。

4.根据权利要求3所述的鲁棒性提高的重组大肠杆菌，其特征在于，所述对內源MEP途径关键限速酶进行人工调控是将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因Dxs和异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi的启动子分别替换为人工增强启动子M1-37和M1-46；所述M1-37的核苷酸序列包括SEQ ID NO.6所示，M1-46的核苷酸序列包括SEQ ID NO.7所示。

5.一种根据权利要求2所述的鲁棒性提高的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)根据所要替换的基因mgsA，所需整合的M1-93-tErg9人工调控元件，构建相应的pTargetF-N20质粒及DonorDNA；

根据所要替换的基因pta，所需整合的M1-93-shc人工调控元件，构建相应的pTargetF-N20质粒及DonorDNA；

(2)将其中一种pTargetF-N20质粒及DonorDNA采用电转化法转化至含有pCas质粒的大肠杆菌感受态中；

诱导pCas质粒上sgRNA的转录，消除pTargetF-N20质粒并筛选出基因改造成功的菌株；

(3)将另一种未转化的pTargetF-N20质粒及DonorDNA转化至步骤(2)中得到的菌株中，诱导pCas质粒上sgRNA的转录，消除pTargetF-N20质粒并筛选出基因改造成功的菌株；

(4)消除pCas质粒，得到引入了外源人工合成途径的重组大肠杆菌。

6.根据权利要求5所述的鲁棒性提高的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，将所述引入了外源人工合成途径的重组大肠杆菌通过λ-Red一步重组法将內源限速酶基因dxs和idi的启动子分别替换为人工增强启动子M1-37和M1-46，所述M1-37的核苷酸序列包括SEQID NO.6所示，M1-46的核苷酸序列包括SEQ ID NO.7所示。

7.根据权利要求5所述的鲁棒性提高的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中转化的是根据所需整合的人工调控元件M1-93-tErg9的pTargetF-N20质粒及DonorDNA；步骤(3)中转化的是根据所要替换的基因pta，所需整合的M1-93-shc人工调控元件，构建相应的pTargetF-N20质粒及DonorDNA。

8.根据权利要求5所述的鲁棒性提高的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，DonorDNA是通过根据所要整合的人工调控元件M1-93-tErg9、M1-93-shc设计上、下游同源臂，再分别与M1-93和tErg9、M1-93和shc进行一步同源重组整合构建而得；在步骤(4)中，不加任何抗生素37℃过夜培养步骤(3)构建的菌株，以消除pCas质粒。

9.一种鲁棒性提高的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为大肠埃希氏菌Escherichia coli Hop1菌株，保藏编号为CGMCC NO.26270。

10.一种根据权利要求1-4中任一项所述的重组大肠杆菌，或根据权利要求5-8中任一项所述方法构建得到的重组大肠杆菌在底盘细胞生产目标化合物中的应用。