[发明专利]一种基于细菌外膜囊泡的蛋白质递送的方法

说明书

本发明提供了一种基于细菌外膜囊泡的蛋白质递送的方法，该方法先将含目的蛋白的分泌表达型质粒导入细菌中培养，再通过IPTG诱导表达使目的蛋白包裹进入细菌外膜囊泡，随后细菌外膜囊泡与细胞共培养，将包裹的目的蛋白递送进胞质。本发明拓宽了细菌外膜囊泡包裹的异源蛋白的种类和数量，保证了多种异源蛋白向胞质的高效递送，为胞内成像及纳米抗体等治疗性蛋白的胞内靶点的开发提供了可行性方案。

技术领域

本发明属于合成生物学、免疫学技术领域，具体涉及一种基于细菌外膜囊泡的蛋白质递送的方法。

背景技术

蛋白质在科学研究和临床治疗方面已经得到了广泛的应用，包括在细胞成像、诊断、信号通路研究等研究中提供标记的蛋白。同样，对应于药物开发来说，蛋白质类药物的开发越来越受到人们的关注，然而，由于受到胞质递送方法的限制，蛋白质药物一般靶向于膜外受体。将蛋白质有效地递送进细胞中，很大程度上扩大疾病治疗目标，能够提供更多包括纳米抗体在内的治疗方案，治疗更多的疾病。

细胞内蛋白递送的意义已经得到了广泛的认可，在过去的几十年里已经有包括物理方法、细胞穿膜肽、脂质体、纳米载体等多种方法用于细胞内蛋白质递送，但大多数方法在不同的方面都存在限制。物理方法包括电穿孔、显微注射、纳米针几种，它们往往会对细胞膜造成损伤，而且操作复杂，通量小。纳米颗粒，如脂质型纳米颗粒、聚合物胶束纳米颗粒、无机纳米材料，需要与货物非共价结合，因此，它们往往只能针对具有某一表面特征的一类蛋白进行递送。

为了克服在蛋白递送过程中的种种困难，我们尝试利用细菌外膜囊泡这种生物相容性高的生物源材料为载体进行蛋白递送。细菌外膜囊泡是一种在细菌生长过程中产生的，直径在50-250 nm的球形膜结构，能包裹周质空间中的各种分子。已有研究表明，因其结构与细胞膜类似，它表现出极高的生物相容性，因此，将生物活性蛋白递送至细胞中，可以通过细菌外膜囊泡介导的生物途径。但目前通过细菌外膜囊泡将蛋白递送进胞质的方法存在递送效率较低的问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提供一种基于细菌外膜囊泡,实现将异源蛋白高效递送进胞质的的蛋白质递送的方法。

为实现以上目的，本发明的技术方案如下：

一种基于细菌外膜囊泡的蛋白质递送的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备含目的蛋白的分泌表达型质粒，并将其导入细菌中培养；

步骤二、IPTG诱导表达，使目的蛋白包裹进入细菌外膜囊泡；

步骤三、细菌外膜囊泡与细胞共培养，将包裹的目的蛋白递送进胞质。

所述步骤一中，制备含目的蛋白的分泌表达型质粒包括：采用基因工程方法在目的蛋白的DNA序列前插入分泌型信号序列，构建到表达载体上，得到含目的蛋白的分泌表达型质粒。

所述步骤二，诱导温度为35-38℃。

所述步骤二，诱导表达时间为5-40 h。

所述方法还包括利用小分子对包裹于囊泡中的目的蛋白直接进行偶联修饰，该步骤位于步骤二之后、步骤三之前。

所述利用小分子对包裹于囊泡中的目的蛋白直接进行偶联修饰包括以下步骤：

S1、向包裹目的蛋白后的细菌外膜囊泡中加入小分子后孵育一段时间，得到混合体系；

S2、用PBS对混合体系进行透析，以除去游离的未偶联的小分子。

所述步骤S1，孵育温度为0-15℃。

所述目的蛋白为用于基础研究或具有治疗作用的蛋白、肽或抗原。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：