[发明专利]基于阳离子聚噻吩进行SNP分型的免PCR扩增的熔解曲线检测方法及应用

权利要求书

1.一种基于阳离子聚噻吩进行SNP分型的免PCR扩增的熔解曲线检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1：根据靶标基因SNP位点的序列，设计针对所述靶标基因SNP位点的探针；

S2：将所述探针的溶液、阳离子聚噻吩溶液和杂化缓冲溶液工作液混合后，获得第一混合液；

S3：将所述第一混合液于荧光定量PCR仪内进行杂化反应，获得含双螺旋复合体的溶液；

S4：将待测样本的基因组DNA溶液与所述含双螺旋复合体的溶液混合后，获得第二混合液；

S5：将所述第二混合液于荧光定量PCR仪内进行杂化反应，获得含三股螺旋复合体的溶液；对所述含三股螺旋复合体的溶液逐渐升温并采集荧光，获得熔解曲线；

S6：对所述熔解曲线进行分析，并根据熔解峰形状及熔解峰Tm值的差异判断待测样本中靶标基因SNP位点的基因型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针的溶液中探针的浓度为40~60nM，且所述探针的长度为25~35bp，Tm值为50~80℃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述阳离子聚噻吩溶液中的阳离子聚噻吩为聚(3-[(S)-5-氨基-5-羧基-3-戊氧基]-2,5-噻吩氯化物，且所述阳离子聚噻吩溶液中的聚(3-[(S)-5-氨基-5-羧基-3-戊氧基]-2,5-噻吩氯化物的浓度为（0.8~1.2）×10^-6g/mL；优选为1.0×10^-6g/mL 。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述杂化缓冲溶液工作液由杂化缓冲溶液进行10倍稀释后制得，所述杂化缓冲溶液的pH 值为8.0~9.5，其中包括180~220mM的Tris-HCl，80~120mM的KCl，80~120mM的(NH₄)₂SO₄，18~22mM的MgSO₄，0.8~1.2wt% 的TritonX-100和0.8~1.2mg/mL的BSA；优选地，所述杂化缓冲溶液的pH 值为8.8，其中包括200mM的Tris-HCl，100mM的KCl，100mM的(NH₄)₂SO₄，20mM的MgSO₄，1wt% 的Triton X-100和1mg/mL的BSA。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述探针的溶液、阳离子聚噻吩溶液和杂化缓冲溶液工作液的体积比为（1~3）:（1~3）:1；优选为2:2:1。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述杂化反应的程序为：95℃变性2~8分钟，45~55℃孵育5~15分钟。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述待测样本的基因组DNA溶液中DNA的浓度为20~70 ng/μL，且所述待测样本的基因组DNA溶液与所述含双螺旋复合体的溶液的体积比为（1~2）:1，优选为1.5:1。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S5中，熔解曲线获得过程中所述杂化反应和升温的程序为：95℃变性2~8分钟，45~55℃孵育1~5分钟，由45~55℃升温至85~95℃，并以0.04℃/s~0.06℃/s的升温速度采集荧光信号。

9.一种如权利要求1-8中任意一项所述的基于阳离子聚噻吩进行SNP分型的免PCR扩增的熔解曲线检测方法在基于POCT模式的HLA-B*5801基因型检测中的应用。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述应用在检测中采用的探针的序列如SEQ ID NO.1所示。