[发明专利]一种基于TMEM196基因的结肠癌检测试剂、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种基于TMEM196基因的结肠癌检测试剂、试剂盒及应用,检测试剂包含用于RT‑PCR方法检测TMEM196基因表达水平的特异性引物对、和/或用于MSP方法检测TMEM196基因启动子甲基化状态的特异性引物对、和/或用于MSP方法检测TMEM196基因启动子非甲基化状态的特异性引物对、和/或用于数字PCR技术检测TMEM196基因启动子甲基化状态的特异性引物对和探针。试剂通过特异性引物可以与TMEM196基因及其TMEM196基因启动子区域甲基化位点进行特异性结合，灵敏、快速、准确地检测TMEM196的表达水平及其甲基化水平。利用本发明的检测试剂及试剂盒，可以在结肠癌的一种或多种不同类型样本中检测TMEM196的表达水平及甲基化状态，为结肠癌的诊断、风险预测、预后判断提供依据，效率高、成本低。

技术领域

本发明属于生物医学诊断技术领域，具体涉及一种基于TMEM196基因的结肠癌检测试剂、试剂盒及应用。

背景技术

癌症是严重威胁人类生存和社会发展的重大疾病，是21世纪中国和世界最严重的公共卫生问题之一。我国居民的癌症发病率总体呈现上升趋势。在我国，最常见的肿瘤为肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和乳腺癌。下面以结肠癌为代表，对DNA甲基化检测技术在实体肿瘤中的应用现状和前景进行介绍。

结肠癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率和肿瘤相关死亡率在各类恶性肿瘤中均位居第三。由于结肠癌早期无特异性临床表现且缺乏高灵敏度和特异性的早期诊断技术，大部分患者确诊时已是癌症晚期，术后5年存活率极低(低于20％)。所以，早期发现，早期诊断，早期治疗是提高结肠癌治疗效果的最有效方法。

肿瘤早期诊断通常取决于两个关键因素：检查指标的高度特异敏感和检测方法的无创易行。粪便隐血检测和钡剂灌肠气钡双重造影是当前结肠癌筛查最为广泛的方法，但由于各自技术限制，特异性差、漏诊率高。电子结肠镜检查是结肠癌诊断的金标准，但属于侵入性操作，不适宜早期筛查。而现行结肠癌筛查应用的经典肿瘤标志物如CEA、CA199特异性及敏感性较差。因此，亟需寻找及开发出经济简便、高灵敏度特异度的分子标志物进行肿瘤的早期筛查和诊断。

近年来，DNA甲基化在结肠癌中的研究取得较大进展，为实体肿瘤的早期诊断、风险评估、预后判断和干预治疗提供了新的思路和靶点。以往的研究主要侧重于探索单个抑癌基因的甲基化状态与肿瘤临床病理学指标的相关性，以及其在实体肿瘤发生发展中的作用和机制，验证这些基因可否作为实体肿瘤早期诊断或预测预后的分子标志物。目前已经通过独立研究证实的具有较高甲基化频率的基因包括：APC、SEPT9、SFRP1/2、RASSF1A、MGMT和WIF1等。

随着分子生物学和分子检测技术的发展，使用一些高通量的甲基化检测方法可以实现同时检测多个甲基化位点，但不同的高通量方法检测的甲基化位点各不相同，结果的重复性较差。并且大多数研究只是检测肿瘤中基因的甲基化情况，缺少正常对照，无法评价其作为诊断指标的敏感性和特异性。

发明内容

本发明通过GEO及TCGA数据库分析以及RT-PCR和实时定量PCR验证发现，TMEM196在结肠癌组织中的表达明显低于对应的癌旁组织，同时TMEM196表达低的结肠癌患者预后较差，TMEM196在绝大多数结肠癌细胞中表达沉默或下调。通过TCGA数据库分析和甲基化检测验证，结直肠癌组织TMEM196表达与甲基化水平呈负相关，结直肠癌患者血浆DNA中，TMEM196甲基化检出率明显高于健康志愿者，使用去甲基化药物5-Aza-dC和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理结肠癌细胞后发现，可明显恢复TMEM196的表达，说明TMEM196启动子区发生高频甲基化是导致TMEM196在肿瘤中表达沉默的主要原因。通过实验验证发现，TMEM196还在结肠癌中发挥抑癌作用。因此，通过检测TMEM196基因的表达水平或甲基化状态，可以进行结肠癌的诊断、风险预测和预后判断。

本发明的目的在于提供一种基于TMEM196基因的结肠癌检测试剂、试剂盒及应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：