[发明专利]一种用于制备母乳寡糖的核酸分子、表达载体和微生物

说明书

本发明提供了一种编码BKHT蛋白的核酸分子，核酸分子包括如SEQ IDNO.2所示序列或与SEQ ID NO.2具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。该核酸分子编码的BKHT蛋白来源于幽门螺杆菌属Helicobacter sp.13S00401‑1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该蛋白具有优越的α‑1,2‑岩藻糖基转移酶催化活性和严格的底物特异性，将其用于催化GDP‑岩藻糖和乳糖合成2'‑岩藻糖基乳糖时，2'‑岩藻糖基乳糖的产量可达到94.68g/L，乳糖转化率可达到0.98mol 2'‑FL/mol乳糖，尤其是无副产物双岩藻糖基乳糖的生成，具有良好的产业化前景。

技术领域

本申请涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于制备母乳寡糖的核酸分子、表达载体和微生物。

背景技术

母乳低聚糖(HMOs)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第3大固形物质，是婴儿发育不可或缺的成分。在200多种鉴定的HMOs中，2'-岩藻糖基乳糖(2'-Fucoselactose，2'-FL)，是HMOs中含量最高的低聚糖，也是最早被美国FDA和欧盟批准可添加到婴幼儿奶粉、普通食品、膳食补充剂和/或医疗食品中的HMOs之一，受到广泛关注。但是目前2'-FL的生产成本较高且生产方法有一定局限性。

当前，2'-岩藻糖基乳糖的生产方式主要包括化学法合成、酶催化法合成和微生物发酵法三种方式。化学法合成所需原料成本高，且需要引入保护基团，步骤繁冗。相比之下，酶催化法和生物发酵法，反应条件温和、绿色，是最具竞争力的生产方式。

酶催化法或生物发酵法生产2'-岩藻糖基乳糖的核心在于筛选高活性、高底物特异性的ɑ-1,2-岩藻糖基转移酶。目前，公开用于合成2'-FL的ɑ-1,2-岩藻糖基转移酶主要是幽门螺杆菌属来源FucT2和大肠杆菌O126来源WbgL，但这两个酶仍然存在催化活力不高、底物特异性差等问题，在合成2'-FL的同时伴随副产物二岩藻糖四糖DFL的合成，大大增加了下游分离纯化的成本，同时也降低了乳糖对2'-FL的转化率，无形之中也增加了物料投入成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于制备母乳寡糖的核酸分子、表达载体和微生物。其一，本申请通过筛选获得了一种具有α-1,2-岩藻糖基转移酶功能的BKHT蛋白，可以特异性催化2'-岩藻糖基乳糖的合成；其二，本申请中对上述BKHT蛋白进行了密码子优化获得了其编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，进而构建了BKHT表达载体以及含有BKHT编码基因和BKHT表达载体的微生物，为母乳寡糖合成提供了一种适应性好、产量高、且无副产物生成的工程菌；其三，本申请提供了采用上述核酸分子、表达载体和微生物制备母乳寡糖的方法，尤其是2'-岩藻糖基乳糖的制备方法。

一方面，本申请提供了一种编码BKHT蛋白的核酸分子，所述核酸分子包括如SEQID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。

优选的，所述核酸分子包括与SEQ ID NO.2具有至少98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的核苷酸序列。

更优选的，所述核酸分子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述BKHT蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示序列或与SEQ IDNO.1具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。

更优选的，所述所述BKHT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

另一方面，本申请还提供了一种含上述核酸分子的表达载体。

优选的，所述表达载体为pET表达载体和/或pRSF表达载体。