[发明专利]一种（+）γ-内酰胺酶基因的克隆与表达方法及其应用

说明书

本发明属于基因工程领域，公开了一种(+)γ‑内酰胺酶基因的克隆与表达方法及其应用。采用菌株发掘出产(+)γ‑内酰胺酶的基因，将其进行目的基因扩增，构建工程菌，用来生产(+)γ‑内酰胺酶，从而进行工业化生产(‑)γ‑内酰胺。

技术领域

本发明属于基因工程领域，本发明涉及一种(+)γ-内酰胺酶基因的克隆与表达方法及其应用。

背景技术

作为酰胺酶的其中一种，γ-内酰胺酶能选择性降解工业上的(±)γ-内酰胺。光学纯的(-)γ-内酰胺是制备抗病毒药物的手性中间体，是抗艾滋病药物(-)阿巴卡韦和(-)卡巴韦的合成原料，也是抗流感药物帕拉米韦的合成原料。而(+)γ-内酰胺酶因其能降解(+)γ-内酰胺，从而得到光学纯的(-)γ-内酰胺受到格外关注。

临床上已知阿巴卡韦的药理活性来源于(-)阿巴卡韦，因而科学工作者们的目光都锁定在了挖掘(+)γ-内酰胺酶上，试图利用(+)γ-内酰胺酶拆分(±)γ-内酰胺，从而得到光学纯的(-)γ-内酰胺以满足生产需要。(+)γ-内酰胺酶能够高效率动力学拆分外消旋体γ-内酰胺，获得光学纯的(-)γ-内酰胺。运用生物酶法进行工业化生产(-)γ-内酰胺，具有反应条件温和，产物光学纯度高，环境友好等优点。然而野生菌同时包含(±)γ-内酰胺酶不利于生产应用，因而十分有必要将单一γ-内酰胺酶基因进行异源表达以提高对异构体的选择性。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种(+)γ-内酰胺酶基因的克隆与表达方法及其应用，解决了现有野生菌株活力低，发酵时间长等缺点，具有广泛的工业应用前景。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种产(+)γ-内酰胺酶的基因工程菌，是将菌株BH24(登记号：NR 114581；网站：中国普通微生物菌种保藏管理中心)的(+)γ-内酰胺酶基因导入大肠杆菌BL21构建获得。菌株BH24筛选于渤海海泥，通过双层平板法进行初筛、复筛所得。

一种产(+)γ-内酰胺酶的基因工程菌的构建方法；以BH24为出发菌株，经比对获得菌株BH24的(+)γ-内酰胺酶基因，通过基因合成获得基因，并构建表达载体pMD19-kA，将表达载体倒入大肠杆菌BL21构建获得所述的产(+)γ-内酰胺酶的基因工程菌菌E.coliBL21/pET28a。

所述的构建方法包括如下步骤：

(1)获得目的序列

苏云金芽孢杆菌BH24为出发菌株以Bacillus thuringiensis基因组数据为参考，通过关键词检索出1条潜在的目的蛋白编码基因；

(2)目的基因扩增

按照细菌基因组提取试剂盒使用说明从24℃、180r/min培养过夜的Bacillusthuringiensis菌液中提取细菌基因组；

引物AF序列为：5'-ACGCGTCGACATGGGTAGTAGTGGAAGTATGGTAAAGCAR-3'

引物AR序列为：5'-CCGCTCGAGCTAAGAATGAATCGTTTTTTTTACTGGA-3'

(3)重组质粒pMD19-T-kA的构建

PCR克隆检索出的潜在目的基因，连接到pET28a(+)中构建重组质粒pMD19-T-kA。用酶Sal I、Xho I同时酶切(+)γ-内酰胺酶基因和载体pET28a(+)，将酶切回收产物用T4-DNA连接酶连接起来，构成重组质粒pMD19-T-kA；

(4)表达载体pMD19-kA的构建

提取pET-28a质粒和pMD19-T-kA克隆载体菌株进行质粒进行Sal I/Xho I双酶切。将酶切后的pET-28a质粒与酶切回收的kA片段连接后形成表达载体pMD19-kA；