[发明专利]一种隐球菌的鉴定方法、引物对及试剂盒

说明书

本申请涉及一种隐球菌的鉴定方法、引物对及试剂盒，方法包括：获取待测样本的基因组DNA；通过聚合酶链式反应PCR对所述基因组DNA的URA5基因进行扩增以获取扩增产物；对所述扩增产物进行sanger测序；根据所述URA5基因的562位点测序结果确定所述隐球菌的类型。本申请的隐球菌鉴定方法能够在隐球菌的一级分型的基础上确定隐球菌二级分型，准确判断隐球菌的亚型从而帮助提升对隐球菌引起的疾病的早期干预与治疗。

技术领域

本发明属于真菌病原学检测技术领域，具体涉及一种隐球菌的鉴定方法、引物对及试剂盒。

背景技术

隐球菌是一类能够导致隐球菌病的真菌，在真菌分类学上属于半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母科。隐球菌病是由隐球菌引起的肺部或散播性感染性疾病，主要引起肺炎、脑膜炎、皮肤或脏器感染。隐球菌的属内种类众多，其中引起人类感染的主要有新生隐球菌和格特隐球菌。不同类型的隐球菌在流行病学和临床致病过程中存在明显差异，例如，新生隐球菌主要感染免疫抑制人群，而格特隐球菌主要感染免疫正常人群并以肺部感染为主。

由于不同类型的隐球菌的致病率以及致死率不同，判断是哪种隐球菌引起的疾病对隐球菌病诊断和治疗至关重要。因此，如何鉴定隐球菌的类型成为一项亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种隐球菌的鉴定方法、引物对及试剂盒，该方法能够在准确对VGIa型隐球菌进行鉴定，从而帮助提升对隐球菌引起的疾病的早期干预与治疗。

第一方面，本申请提供一种隐球菌的鉴定方法，所述方法包括：获取待测样本的基因组DNA；通过聚合酶链式反应PCR对所述基因组DNA的URA5基因进行扩增以获取扩增产物；对所述扩增产物进行sanger测序；根据所述URA5基因的562位点测序结果确定所述隐球菌的类型。

对隐球菌的分子分型通常仅限于一级分型，即将隐球菌分为VGI、VGII、VGIV型隐球菌等。发明人基于前期的下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)及分析结果发现VGI型隐球菌可进一步分为VGIa，VGIb，VGIc和VGId型隐球菌，即二级分型。不同亚型的隐球菌的致病性也存在明显差异。本申请提供的隐球菌的鉴定方法能够准确鉴定隐球菌的亚型，通过对待测样本的DNA进行的URA5基因的扩增，经过sanger测序得到URA5基因562位点的测序结果，能够通过该测序结果精确检测隐球菌的亚型，换言之，该隐球菌是否是VGIa型隐球菌，由此，在临床诊断中帮助判断引起感染的隐球菌类型。另外，本申请提供的隐球菌的检测方法无需使用复杂、昂贵的仪器设备即可实现，能够节省隐球菌的检测成本，扩展临床检测的使用场景。

在一些实施例中，所述根据所述URA5基因的562位点的测序结果确定所述隐球菌的类型包括：在所述URA5基因的562位点为鸟嘌呤G的情况下，确定所述隐球菌为VGIa型隐球菌；在所述URA5基因的562位点为腺嘌呤A、胞嘧啶C或胸腺嘧啶T的情况下，确定所述隐球菌为野生型隐球菌。

应理解，野生型隐球菌指除了VGIa型隐球菌以外的隐球菌。本申请的实施例中，通过检测URA5基因的562位点是否为G，能够准确判断待测样本中的隐球菌是否是VGIa型隐球菌，从而帮助诊断引起感染的隐球菌亚型。

在一些实施例中，所述PCR的反应物包括URA5正向引物和URA5反向引物；其中，所述URA5正向引物的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述URA5反向引物的核苷酸序列如SeqID No.2所示。

在一些实施例中，在获取所述扩增产物后，所述方法还包括：确认所述URA5基因扩增成功。

在一些实施例中，通过凝胶电泳法确认所述URA5基因扩增成功。

本申请实施例中，在得到扩增产物后，进行sanger测序前，用凝胶电泳法确认扩增是否成功，能够避免扩增不成功即进行sanger测序导致的时间与成本的浪费，提高隐球菌分型的效率。