[发明专利]PKK-TPP多肽探针在区分细胞周期不同阶段中的新应用

说明书

本发明提供PKK‑TPP多肽探针在区分细胞周期不同阶段中的新应用。当活细胞与多肽探针共孵育后，用激光共聚焦显微镜对其进行荧光检测，可有效地区分出活细胞属于G1期、S期和G2/M期细胞。本发明首次利用不同周期细胞摄取多肽探针导致细胞内的探针富集程度及荧光强度差异，最终达到活细胞中准确区分细胞周期及快速评估周期靶向药物疗效及耐药性的技术效果。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及PKK-TPP多肽探针在区分细胞周期不同阶段中的新应用。

背景技术

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，对细胞周期的分析能更深入地了解疾病发生的本质。细胞周期是控制基因复制和细胞分裂的过程。由于增殖细胞经历了不同的生长和合成时期，细胞周期的各个阶段通常被划分为G1、S、G2和M阶段。如果错过了细胞周期检查点，就会导致异常的细胞分裂，从而导致癌症或其他可怕疾病的出现。

有研究报道癌细胞与正常细胞相比复制速度非常快，对细胞周期扰动非常敏感。因此，细胞周期被认为是癌症纳米药物开发的一个有价值的靶点，许多抗癌药物被证明是通过在特定的细胞期阻滞细胞发挥其治疗作用的。因此，了解细胞周期中细胞的准确阶段对药物筛选和肿瘤生长研究至关重要。

目前，研究人员已经报道了大量的方法来识别活细胞中细胞周期的阶段，如电化学法、荧光法等等。其中荧光法具有较高的选择性和灵敏度等优点，被广泛应用于活细胞的细胞周期成像和筛选。然而，在活细胞中细胞周期状态的可视化主要依赖于引入各种编码荧光周期特异性蛋白表达质粒，由于质粒的转染及转化过程是耗时的，并可能影响细胞功能。因此，在活细胞中工作简单而快速的荧光生物传感器对于监测细胞周期进展仍具有重要意义。

发明内容

基于此，有必要提供PKK-TPP多肽探针在区分细胞周期不同阶段中的新应用，能够在活细胞中实现快速荧光鉴定及特异性周期靶向药物作用效果的筛选。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供PKK-TPP多肽探针在区分细胞周期不同阶段中的应用，所述PKK-TPP多肽探针的结构式为：

利用所述PKK-TPP多肽探针测定细胞周期不同阶段的方法步骤为：将细胞周期同步化处理的活细胞(癌细胞)与所述PKK-TPP多肽探针共同孵育，洗涤除去未与细胞结合的多肽探针，得待测试样；利用激光共聚焦显微镜对所述待测试样进行荧光成像，激光共聚焦激发光波长为488nm，发射光波长范围为650～750nm，获得共聚焦显微镜图像；分析共聚焦显微镜图像的探针摄取量及其发射荧光强度。

以PKK-TPP多肽探针的应用浓度为5μM、孵育3小时为优选参数，当共聚焦图像的荧光强度位于10-15之间，即可判断其处于S期；当荧光强度位于5-10之间确定活细胞属于G1期；或者当荧光强度位于0-5之间即可判断其处于G2/M期。

在其中一些实施例中，获取细胞周期同步化的活细胞的方法：将活细胞通过血清饥饿处理使其停滞在G1期；或者将活细胞药物处理，使其停滞在S期或者G2/M期。

优选地，所述共同孵育的培育条件为36～37℃。

优选地，所述PKK-TPP多肽探针的应用终浓度为1～10μM，优选5μM。

优选地，洗涤采用的洗涤剂为PBS缓冲液。

本发明进一步提供PKK-TPP多肽探针在评估细胞周期靶向药物的疗效或者鉴定细胞周期靶向药物的耐药性中的应用。

所述鉴定细胞周期靶向药物疗效的应用包括如下步骤：采用细胞周期靶向药物对细胞进行预处理，再将预处理后的细胞与所述PKK-TTP多肽探针共同孵育，待孵育结束，洗去未与细胞结合的多肽探针，得到细胞待测试样；采用激光共聚焦显微镜检测所述待测细胞试样的荧光，与不同细胞周期预设标准荧光强度作对比，确定细胞周期靶向药物的效果。