[发明专利]一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法及其应用

说明书

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体而言，涉及一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法及其应用。选用盛花期十字花科植物，所述十字花科植物为拟南芥、白菜型油菜、甘蓝型油菜等、任何含有目的基因的重组二元载体、农杆菌GV3101作为实验对象，不需要经过复杂、技术含量要求高的组织培养和重新诱导分化，即可直接获得转基因植物，本发明提供的用于十字花科植物转基因的改良蘸花法，可有效快速进行拟南芥、白菜型油菜、甘蓝型油菜等植物的转基因；本发明提供的用于十字花科植物转基因的改良蘸花法，可用于转基因的植物包含但不限于十字花科植物拟南芥、白菜型油菜、甘蓝型油菜等，其他十字花科植物的应用均在本发明保护内。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体而言，涉及一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法及其应用。

背景技术

十字花科作物包括白菜、甘蓝、菜心、白菜型油菜、甘蓝型油菜等，是世界上重要的蔬菜、油料作物，然而这些作物的分子遗传育种常需组织培养方法进行转基因操作，耗时耗力。而同为十字花科的模式植物拟南芥的转基因技术主要是利用农杆菌介导的蘸花法(floral-dipmethod)进行转化。该方法简单，不需要经过复杂、技术含量要求高的组织培养和重新诱导分化，即可直接获得转基因植物。因此，本发明涉及一种用于十字花科植物快速转基因的改良蘸花法及其应用，可为十字花科作物的基因功能、遗传育种研究提供便利，具有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的就是针对背景技术中存在的问题，提出一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法及其应用，不需要经过复杂、技术含量要求高的组织培养和重新诱导分化，即可直接获得转基因植物。

本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：

一种用于十字花科植物转基因的改良蘸花法，包括以下步骤：

(1)选用盛花期十字花科植物，所述十字花科植物为拟南芥、白菜型油菜、甘蓝型油菜等、任何含有目的基因的重组二元载体、农杆菌GV3101作为实验对象；

(2)摇菌：将前期测序验证正确的重组质粒转化农杆菌GV3101，涂布在含有选择抗生素的YEB固体培养基上，28℃培养箱倒置培养48～72h，挑取单克隆在5mLYEB液体培养基(含相应载体选择抗生素)的试管中，28℃、200rpm摇菌24h，之后转50mLYEB液体培养基(含载体选择抗生素：Kana的浓度为100μg/mL，Rif的浓度为50μg/mL)进行28℃、200rpm大摇，摇菌至OD600＝0.8～1.2；

(3)农杆菌重悬：将培养好的农杆菌菌液分装于50mL离心管中，配平后在室温下以5000rpm转速离心10分钟，富集农杆菌菌体，弃去上清液；用新配制的重悬液对50mL离心管中沉淀的菌体进行重悬，并用新配制的重悬液调整农杆菌重悬液浓度至OD600＝0.8～1.0；

(4)侵染：将已处理过的拟南芥、白菜型油菜、甘蓝型油菜等的花序倒置浸没在农杆菌重悬液进行轻微晃动浸染15～30s，然后稍喷洒些无菌水保湿，并用一次性手套覆盖，黑暗培养24h，然后去除黑暗和一次性手套后，即可正常培养。为提高侵染效率，2～3天后可以重复侵染一次；

(5)侵染后管理：花序开花正常时(侵染2～3天后)；每天查看已侵染花序，可用同菌株已侵染花序适当碰触授粉，以提高种子结荚率，结荚后，尽量减少浇水量，两到三周浇一次水即可；

(6)筛选鉴定：正常培养植株至收取种子后，在含有筛选抗生素的MS固体培养基上进行筛选，7～21天即可筛选成功，将阳性苗稍炼苗后转至土培培养，土培生长健壮后的材料可根据需要提取DNA、RNA、蛋白等进行下游鉴定分析。

优选的，所述新配制的重悬液配方为：40ml无菌水+2g蔗糖(5％)+20uLSilwetL-77(0.05％)。