[发明专利]一种用于检测猪萨佩罗病毒的芯片式数字PCR试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测猪萨佩罗病毒的芯片式数字PCR试剂盒，涉及分子生物技术领域。该芯片式数字PCR试剂盒，包括一种引物对和探针组合，所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明建立了关于猪萨佩罗病毒的芯片式数字PCR检测方法，基于此，本发明提供了一种用于检测猪萨佩罗病毒的芯片式数字PCR试剂盒，该试剂盒对于猪萨佩罗病毒的定量检测特异性强，灵敏度高，重复性稳定，对于猪萨佩罗病毒的早期诊断和生物安全临床防治提供了较为重要的指导意义。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种用于检测猪萨佩罗病毒的芯片式数字PCR试剂盒。

背景技术

猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus；PSV)可引起猪腹泻、肠炎、肺炎、生殖障碍、非化脓性脑炎、脊髓灰质炎、心包炎、心肌炎、皮肤损伤和神经系统紊乱等多系统综合征。在部分养猪场中猪萨佩罗病毒阳性率高达60％，而且在临床上易与猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒(PCV)等发生混合感染的现象。猪萨佩罗病毒能在猪肠道上皮细胞繁殖，可见小肠绒毛萎缩、减少，小肠固有层出血性渗出，感染猪康复后依然会继续排毒，怀孕母猪感染后，病毒血症经血源传播，导致胚胎和胎儿感染，造成胚胎死亡、死产、木乃伊胎和胎儿畸形等，该病毒给养殖猪业造成了严重的经济损失。目前对猪萨佩罗病毒的研究较少，而且针对猪萨佩罗病毒并没有商品化疫苗，没有有效的治疗措施，也使得其目前只能以预防为主。因此面对猪萨佩罗病毒，采取及时的早期诊断与预防措施并及时处理疑似或发病的猪，是给养猪业安全保障的重要手段。

目前针对猪萨佩罗病毒的常用检测方法主要是病毒分离和鉴定，间接ELISA，逆转录PCR和TaqMan实时定量PCR等方法。病毒分离与鉴定需要高昂的仪器与复杂的操作流程，对临床快速诊断有一定局限性；间接ELISA操作方法简单，但需要动物血清，且无法对病原分子进行检测；虽然TaqMan实时荧光定量PCR(RT-qPCR)灵敏性较强，但这种方法极度依赖于Ct值和标准曲线，当遇到样本浓度过低或者存在抑制剂的情况下，对病毒感染早期的模板难以进行精确检测。因此，亟需开发一种关于猪萨佩罗病毒的高灵敏度的检测技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测猪萨佩罗病毒的芯片式数字PCR试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，该试剂盒对于猪萨佩罗病毒的定量检测特异性强，灵敏度高，重复性稳定，对于猪萨佩罗病毒的早期诊断和生物安全临床防治提供了较为重要的指导意义。

芯片式数字PCR(Chip Digital PCR，cdPCR)是一种基于单分模板扩增，能够快速并准确地将样品流动后分成若干个独立的单元，实现拷贝数级别精确定量的分析技术。一个芯片有20000个液滴，在芯片的微滴中，每个单元包含0个、1个、个别有多个目标核酸分子，能形成液滴大小均一的物理分区，然后在每个反应单元中分别对样品进行扩增，扩增结束之后依据泊松分布的原理，根据阳性微滴与阴性微滴数的比例计算目标分子的拷贝数，实现灵敏度达到0.01％的对目标片段的绝对定量。突破了传统PCR检测在区分较小的拷贝数差异的局限，特异性更强，重复性优异，无需依赖扩增曲线的循环阈值进行定量，也不必利用标准曲线和内参基因，并且对低浓度的核酸定量更加准确可靠。因此，本发明考虑通过建立猪萨佩罗病毒的cdPCR检测方法来提高猪萨佩罗病毒的检测灵敏度。

本发明根据猪萨佩罗病毒特异性保守基因序列靶点PSV_BRA/UEL-WB20/135'UTR设计特异性引物和探针，建立了猪萨佩罗病毒cdPCR检测方法，并采用建立的cdPCR检测方法对猪萨佩罗病毒临床发病样品及空气样本等进行检测分析，结果显示，该cdPCR检测方法的最低检测限度为3.12copies/μL，与RT-PCR检测方法相比灵敏灵提高约1000倍，与TaqMan实时荧光定量(RT-qPCR)检测方法相比灵敏度提高约10倍。

基于此，本发明提供了如下方案：