[发明专利]毒害艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选与鉴定方法

权利要求书

1.毒害艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.双向电泳：将毒害艾美耳球虫子孢子中可溶性蛋白通过等电聚焦进行第一向分离，再通过凝胶电泳进行第二向分离，使得毒害艾美耳球虫子孢子中可溶性蛋白依次按等电点和分子量进行分离，实现毒害艾美耳球虫子孢子中可溶性蛋白的双向分离，获得蛋白分离凝胶；

S2.蛋白质免疫印迹实验：将经步骤S1分离后的毒害艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白分别与四种鸡艾美耳球虫的高免鸡血清进行蛋白免疫印迹实验，筛选出能够分别被四种高免鸡血清识别的共同免疫原性蛋白。

2.根据权利要求1所述的毒害艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选方法，其特征在于，所述双向电泳包括以下步骤：

1)第一向等电聚焦：先将制备好的毒害艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白沉淀溶解在IPG样本缓冲液中；在室温下，先孵育至少1h，再以15000rpm离心15min，以除去不溶解的物质，获得蛋白质缓冲液；取450μL含有200μg蛋白质缓冲液加载到长度为24cm的pH值为3-10的IPG预制胶条上，然后，使用再水合缓冲液在20℃下水化12h后，在电泳仪EttanIgphorII中，按以下四步进行第一向等电聚焦电泳：

①0-50V，12h；

②50-8000V，4h；

③8000-10000V，4h；

④10000V，4h；

2)第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳：室温下，将完成第一向等电聚焦处理的IPG胶条先在平衡缓冲液Ⅰ中平衡处理后，再在平衡缓冲液II中进行平衡处理，然后将IPG胶条和SDS-PAGE分子量标准品加载到12.5％w/v的SDS-PAGE凝胶上，并使用EttanDALT 12系统进行第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得蛋白分离凝胶。

3.根据权利要求2所述的毒害艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选方法，其特征在于，所述IPG样本缓冲液包括下述组份：8mol/Lurea、2％w/v CHAPS、50mmol/LDTT、0.2％v/vBio-Lyte3-10 ampholytes、及0.001％w/v bromophenol blue；所述平衡缓冲液Ⅰ包括下述组份：375mmol/LTris-HCl、6mol/Lurea、2％w/v SDS、30％v/v甘油、及1％w/vDTT，其用量为10mL，平衡时间为15min；所述平衡缓冲液II包括下述组分：375mmol/LTris-HCl、6mol/Lurea、2.5％w/viodoracetamide、及2％w/v SDS，其用量为6mL，平衡时间为15min；所述50mmol/LTris-HCl的pH为8.8。

4.根据权利要求1所述的毒害艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白中共同免疫原性蛋白的筛选方法，其特征在于，所述蛋白质免疫印迹实验包括以下步骤：

①转膜：将经步骤S1分离获得的毒害艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白分离凝胶上转移到含转膜缓冲液的PVDF膜上，使用半干转印仪进行转印，转印时间为2h，电流/面积为0.70mA/cm²；

②封闭：转膜后，将PVDF在室温下转移至含5％w/v脱脂牛奶、及0.05％v/vTween-20的PBST中封闭2h，然后，用PBST对PVDF洗涤3次，每次10min，其中，封闭所用的PBST的pH为7.4；

③一抗孵育：将高免鸡血清与PBS按体积比1:100进行稀释后均匀加至PVDF膜上，在室温下孵育1h，然后用PBST洗涤3次，每次10min；

④二抗孵育：将HRP标记的山羊抗鸡IgG与PBS按体积比为1:2000的比例稀释后加至PVDF膜上，在室温下孵育1h，然后用PBST洗涤3次，每次10min，将膜彻底清洗；

⑤ECL显影：将ECL显影液A液与B液等体积加入避光的EP管中，混合均匀；在遮光环境中，把二抗后的PVDF膜放入曝光机中，将制备好的ECL混合液均匀滴加至PVDF膜上，并且适当地正反面翻转PVDF膜，使其与ECL混合液均匀接触，并且将空气排尽，防止气泡的产生；调设好设备参数，进行曝光，观察曝光结果，使用Bio-rad凝胶成像系统拍照，获得蛋白质斑点图。