[发明专利]一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法和应用

权利要求书

1.一种基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法，其特征在于，其构建方法包括：DBCO修饰的引发链DNA(T链)与叠氮修饰的抗体进行交联，合成抗体引物复合体，T链特异性触发HCR反应，输出的荧光信号作为报告标签对靶标进行标记，得到基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法。

2.根据权利要求1所述基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法，其特征在于，HCR反应元件为四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4，其序列分别如SEQ IDNO:1-4所示，3’端修饰荧光基团分别是Pacific Blue、FAM、TAMRA和Cy5，激发波长分别为405nm、488nm、560nm和633nm，分别用蓝、绿、黄和红色进行伪彩标记，T链序列如SEQ ID NO:5所示，通过颜色或比例的不同组合方式产生的不同情况作为各靶标的报告标签，对不同靶标输出信号差异化区分。

3.权利要求1或2所述基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法在细胞中多蛋白靶标同时成像中的应用。

4.一种基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述基于HCR反应的荧光条形编码免疫标记信号放大方法构建细胞各蛋白对应的抗体引物复合体，通过抗体端识别靶标以及DNA端触发HCR报告信号，在细胞中对多种蛋白同时孵育标记并进行荧光成像，勾勒细胞整体形态。

5.根据权利要求4所述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，其特征在于，所述细胞为HeLa细胞，采用6种蛋白同时孵育成像，包括以下步骤：

步骤a：设计6组针对HeLa细胞中6种蛋白靶标的信号报告标签的特异性序列，并在不同的发夹上修饰荧光基团，其中6组引发链和荧光报告元件序列分别如下：

Q1组：T链序列如SEQ ID NO:5所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:7-10所示；

Q2组：T链序列如SEQ ID NO:11所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:12-15所示；

Q3组：T链序列如SEQ ID NO:16所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:17-20所示；

Q4组：T链序列如SEQ ID NO:21所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:22-25所示；

Q5组：T链序列如SEQ ID NO:26所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:27-30所示；

Q6组：T链序列如SEQ ID NO:31所示，四个具有茎环结构的发夹DNA链H1、H2、H3和H4序列分别如SEQ ID NO:32-35所示；

步骤b：将6组T链与叠氮修饰的6组靶标抗体在PBS缓冲液中反应，抗体交联DNA，得到用于引发6组HCR反应的抗体引物复合体；

步骤c：步骤b所得的交联抗体在固定的HeLa细胞中同时孵育，并用步骤a所得6组H1、H2、H3和H4链在固定的HeLa细胞中同时进行HCR反应；

步骤d：步骤c所得的孵育完成的HeLa细胞通过共聚焦拍摄，获取同一HeLa细胞中多蛋白的多色成像图。

6.根据权利要求5所述基于荧光条形编码免疫标记的细胞高通量成像方法，其特征在于，步骤b的步骤为：在总体积为100μL的PBS缓冲液中，将靶标对应的抗体与NHS-PEG4-N3交联剂按30μM:1.5mM的摩尔比在室温下1000rpm磁力搅拌2h，超滤离心纯化得到叠氮修饰的抗体；叠氮功能化的抗体与DBCO修饰的T链以10μM:100μM的摩尔比在4℃下孵育1天，同时1000rpm磁力搅拌，多余的T链通过超滤离心去除，T链交联的抗体用1×PBS进行重悬，获得T链标记抗体；6组T链依次对应6种抗体，用相同方式制备得到6种用于免疫标记的DNA修饰抗体引物复合体。