[发明专利]茯苓酸合成的关键基因及应用

说明书

本发明公开了茯苓酸合成的关键基因及应用，该茯苓酸合成的关键基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；关键基因包括PcCPR和CYP5035，PcCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，CYP5035的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；PcCPR和CYP5035均在pESC‑Trp载体质粒上；PcCPR和CYP5035均位于半乳糖启动子之后；PcCPR位于GAL10启动子之后，CYP5035位于GAL1启动子之后，GAL10启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，GAL1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明通过大量前期筛选和实验，找到了以羊毛甾醇为底物，进行C‑16羟基化和C‑20甲基羧基化的茯苓酸合成关键酶基因CYP5035；本发明有望构建完整的茯苓酸生物合成通路，阐释茯苓活性物质合成的内在品质属性，也可为茯苓酸生物合成细胞工厂研究应用提供数据支持，促进中药资源的创新发展。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及茯苓酸合成的关键基因及应用。

背景技术

目前茯苓野生资源濒临枯竭，茯苓酸在茯苓药材中含量低，严重限制了茯苓酸的药用开发。因此，挖掘茯苓酸的生物合成关键酶，将茯苓酸合成与异源表达结合起来，使原本在茯苓等中草药中才能合成的茯苓酸在微生物(如酵母等)中也能合成，具有重要意义。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了茯苓酸合成的关键基因及应用，。

本发明提出的茯苓酸合成的关键基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提出的载体，包含上述茯苓酸合成的关键基因。

本发明提出的微生物，包含上述载体。

本发明提出的上述微生物在茯苓酸合成中的应用。

本发明的有益技术效果：

茯苓野生资源濒临枯竭，茯苓酸在茯苓药材中含量低等问题，严重限制了茯苓酸的药用开发。本专利发明的基因首次构建了茯苓酸从头合成全路径，挖掘得到的茯苓酸的生物合成关键酶，不仅可以用于茯苓生物育种和代谢调控来提高茯苓药材中茯苓酸含量，同时也将茯苓酸合成与异源表达结合起来，使原本在茯苓等中草药中才能合成的茯苓酸在酵母等微生物中也能合成，可以使茯苓酸的含量大大提高，液体发酵后含量可高达17.632ug/L，并降低其生产成本。

附图说明

图1为本发明提出的pESC-Trp、pESC-Trp-PcCPR、pESC-Trp-CYP5035、pESC-Trp-CYP5035-PcCPR等异源表达载体的构建；

图2为本发明提出的含pESC-Trp、pESC-Trp-PcCPR、pESC-Trp-CYP5035、pESC-Trp-CYP5035-PcCPR基因的酵母平板图；

图3为本发明提出的载体中插入基因的PCR验证图；M，marker ladder，1,CYP5035引物PCR检测pESC-Trp；2,CYP5035引物PCR检测pESC-Trp-PcCPR；3,CYP5035引物PCR检测pESC-Trp-CYP5035；4,引物CYP5035 PCR检测pESC-Trp-CYP5035-PcCPR；5,引物PcCPR PCRpESC-Trp；6,引物PcCPR PCR检测pESC-Trp-PcCPR；7,引物PcCPR PCR检测pESC-Trp-CYP5035；8,引物PcCPR PCR检测pESC-Trp-CYP5035-PcCPR；