[发明专利]幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒，其特征在于，包括：等位特异性引物，所述等位特异性引物包括针对幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因设计的引物，其中，所述幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性相关基因选自幽门螺旋杆菌23S，检测位点为A2143G，A2142C，A2142G和无基因突变位点，A2143G，A2142C，A2142G位点为克拉霉素耐药型，无基因突变为克拉霉素敏感型。

2.根据权利要求1所述的一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒，其特征在于，包括：用于检测克拉霉素耐药型菌株A2143G的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

用于检测克拉霉素耐药型菌株A2142C的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

用于检测克拉霉素耐药型菌株A2142G的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

用于检测无基因突变的引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；

引物和探针序列参见表1：

3.根据权利要求2所述的一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性的分析试剂盒，其特征在于，正向引物为通用引物，反向引物3’末端碱基对位于模板上的基因突变碱基或等位点；所述正向通用Tag序列为：5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’，针对克拉霉素相关基因设计的引物包括4条反向引物；分别针对1个野生型基因和3个突变型基因设计。

4.一种包含权利要求1-3任一所述引物的用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂或用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性分析试剂盒。

5.根据权利要求4所述的分析试剂盒，其特征在于，还包括如下试剂中的任意一种或几种：qPCR缓冲液、UDGase，Taq DNA聚合酶、荧光染料、dNTP、引物。

6.一种用于幽门螺旋杆菌克拉霉素耐药性诊断的试剂盒，包括核酸提取试剂盒和如权利要求4-5任一所述的分析试剂盒。

7.一种与如权利要求4-5任一所述的分析试剂盒配套的荧光定量PCR反应体系，所述反应体系如下：

所述荧光定量PCR扩增体系为：

以上试剂来自Yeasen公司的qPCR SYBR Green MasterMix(No Rox)试剂盒；配制好的qPCR扩增体系混合均匀，短暂低速离心后，置于博日荧光定量pcr仪中，按照如下条件进行扩增：

。

8.一种幽门螺旋菌克拉霉素耐药性检测方法，包括以下步骤：

提取幽门螺旋杆菌核酸；

采用权利要求1-3任一所述的分析试剂盒对所提取的核酸中的克拉霉素耐药性相关基因进行荧光定量PCR扩增；

其中，所述荧光定量PCR扩增反应过程中，同时使用所述试剂盒中针对克拉霉素耐药基因设计的引物；

其中，所述荧光定量PCR扩增反应过程包括：

25℃降解含UAT模板5min；

95℃变性5min；

95℃变性10s，56℃退火10s，60℃延伸20s；该步骤进行45次循环；

熔解曲线显示；

反应结束。

9.一种权利要求8所述的基于多基因的幽门螺旋杆菌抗生素耐药性检测方法在非疾病诊断和治疗为目的的方法中的应用，其中所述耐药性针对基因23S中3个点突变导致；所述3个点突变为A2143G点突变，A2142C点突变，A2142G点突变。

10.一种权利要求8所述的基于多基因的幽门螺旋杆菌抗生素耐药性检测方法在药物的研发和/或筛选的应用，其中所述耐药性针对基因23S中3个点突变导致；所述3个点突变为A2143G点突变，A2142C点突变，A2142G点突变。