[发明专利]一种适用于肠道生物毒素检测的人工细胞传感器构建方法

权利要求书

1.一种适用于肠道生物毒素检测的人工细胞传感器构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)适用于人体肠道生物毒素检测的枯草芽孢杆菌底盘的构建

利用多组学数据信息对枯草芽孢杆菌细胞代谢及产电机制进行深入剖析，构建代谢物指纹图谱，设计调控元件单元，调控关键限速酶表达，重构代谢通路；应用合成生物学和生物信息技术，对枯草芽孢杆菌细胞的基因组进行连续多次删减操作，通过设计特定的基因回路进行相关代谢途径修饰，去除非必需序列，逐步精简基因组，重构遗传背景清晰，获得对具有高应激响应特性的底盘细胞；

2)对肠道内生物毒素产生响应的生物探针合成与转化模块的构建

使用双组分系统ThsS/R，在枯草芽孢底盘中分别构建适用于肠道环境中具核梭杆菌FadA粘附素、产肠毒素脆弱类杆菌(ETBF)毒素BFT和白介素响应的遗传回路：首先，将组成型启动子控制下的ThsS/R整合到低拷贝质粒中构建转化模块，使用pSC101复制起点增强质粒稳定性，启动子PphsA控制sfGFP的转录，通过ThsR响应肿瘤标志物；将生成的传感器质粒模块分别转化到枯草芽孢杆菌底盘中，并通过测量细菌定值于肠道中的相应荧光强度来反映肠道环境状况；为了增强不同激发波长荧光信号的输出强度，通过使用不同强启动子和核糖体结合位点的选择在转录和翻译水平上对ThsS/R介导的sfGFP表达响应进行了优化，增强所构建的枯草芽孢杆菌细胞传感器对肠道环境中标志物响应的敏感性和特异性；通过突变引起ThsR的失活，利用荧光显微镜检测ThsR失活前后的荧光强度，验证所构建的人工细胞传感器对肠道环境中标志物响应是ThsS/R系统活动的结果；

3)适用于肠道内生物毒素检测的人工细胞传感器构建方法

在基因组简化底盘细胞基础上，通过合成元件、分步组装已构建的基因回路、功能模块至所构建的枯草芽孢杆菌底盘细胞中，并通过适配性研究优化构建的底盘和各个功能元件模块，最终获得适用于人体肠道环境中生物毒素检测的人工细胞传感器；

4)细胞传感器对肠道内生物毒素响应的效能验证及优化

首先需要构建能够模拟肠道环境的微反应器，用于测试人工构建的细胞传感器性能；根据所构建的枯草芽孢杆菌传感细胞的尺寸大小，设计传感细胞定植区域孔道尺寸，人工构建的细胞经进样孔进入微反应器，待细胞定植后，加入培养液，并通过调控培养液中相应的生物毒素如具核梭杆菌分泌的FadA粘附素、产肠毒素脆弱类杆菌(ETBF)分泌的毒素BFT、白介素含量等，以模拟肠道环境，并进行枯草芽孢杆菌传感细胞的培养，验证和优化构建的枯草芽孢杆菌人工细胞传感器的响应特性，实现对早期结直肠癌的精准检测与预警。

2.根据权利要求1所述的一种适用于肠道生物毒素检测的人工细胞传感器构建方法，其特征在于，在步骤3)中，通过添加标志物实现细胞传感器内元件的感知和荧光蛋白表达，并能实现在枯草芽孢杆菌底盘细胞中稳定表达，达到对标志物及肠道环境的显色响应。