[发明专利]N乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法

权利要求书

1.N乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，所述方法包括通过N乙基马来酰亚胺与双环肽的游离巯基反应进行标记，标记后的双环肽带有1个游离巯基杂质以及带有两个游离巯基杂质分子量使得标记后的双环肽与主峰分子量不同，再通过LC-MS检测，检测到样品中游离巯基杂质的情况。

2.根据权利要求1所述的N乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，标记后的双环肽带有1个游离巯基杂质与主峰分子量相差125Da，标记后的双环肽带有两个游离巯基杂质分子量与主峰分子量相差250Da。

3.根据权利要求1所述的N乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)配制N乙基马来酰亚胺溶液：称取N乙基马来酰亚胺置于容器中，加入乙腈溶解，得到浓度为1mg/mL的N乙基马来酰亚胺溶液；

2)配制双环肽溶液：称取100μL浓度为5mg/mL的双环肽溶液放置于1.5mL离心管中，加入900μL超纯水，得到浓度为0.5mg/mL的双环肽溶液；

3)样品处理：称取步骤2)得到的浓度为0.5mg/mL的双环肽溶液100μL，加入步骤1)得到的N乙基马来酰亚胺溶液，孵育一段时间以充分进行标记；

4)通过LC-MS检测，并处理数据。

4.根据权利要求3所述的N乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，步骤3)中，加入的N乙基马来酰亚胺溶液的体积为125μL；孵育的温度为37℃，孵育时间为20min。

5.根据权利要求3所述的N乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，步骤4)中，检测条件为：DAD检测器波长：260nm；流速：0.6mL/min；柱温：40℃；自动进样器温度：10℃；进样量：10μL。

6.根据权利要求3所述的N乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，步骤4)中，检测时的流动相A为含0.1％三氟乙酸，流动相B为乙腈。

7.根据权利要求6所述的N乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，流动相配比为：0min，90％流动相A：10％流动相B；2min，90％流动相A：10％流动相B；30min，10％流动相A：90％流动相B；31min，90％流动相A：10％流动相B；35min，90％流动相A：10％流动相B。

8.根据权利要求3所述的N乙基马来酰亚胺标记质谱检测双环肽游离巯基的方法，其特征在于，步骤4)中，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，色谱柱的长度为150mm，宽度为4.6mm，填料粒径为5μm。