[发明专利]高表达高活性的脯氨酸羟基化酶L593m、编码基因及其在催化胶原蛋白羟基化中的应用

说明书

本发明公开了一种高表达高活性的脯氨酸羟基化酶L593m，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。还公开了其编码基因、表达载体和表达宿主菌，以及在催化胶原蛋白羟基化中的应用。本发明提供了一种高效表达和活性的脯氨酸4‑羟化酶变体L593m，其氨基酸序列见SEQ:NO.3，核苷酸序列见SEQ:NO.4。相较于L593，脯氨酸4‑羟化酶变体L593m具有表达简单、活性更好、纯化更容易、产量更高等特点，可用于胶原蛋白的体内羟基化，适用于工业化生产和应用。

技术领域

本发明涉及一种高表达高活性的脯氨酸羟基化酶L593m、编码基因及其在催化胶原蛋白羟基化中的应用，属于蛋白表达技术领域。

背景技术

胶原蛋白是生物大分子蛋白，是动物体内结缔组织的主要蛋白成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性大蛋白，占机体总蛋白质的30％～40％，在某些生物体内甚至高达80％以上。胶原蛋白具有很强的生物活性和生物功能，在人体的皮肤、肌腱以及其他结缔组织中参与细胞的迁移、分化和增殖，是新陈代谢的促进剂，可以减缓生物组织衰老和功能减退。因此，胶原蛋白对于老年人、更年期妇女、运动过度者、骨折者或关节容易酸痛者提高生命健康质量尤为重要。随着年龄增长，胶原蛋白会渐渐流失(每年会流失1％的胶原蛋白)，导致细胞间粘多糖减少，结缔组织弹性减弱，皮肤就会失去弹性并变薄、老化。胶原蛋白减少还会导致真皮纤维断裂、脂肪萎缩、汗腺及皮脂腺分泌减少，最终出现皮肤干燥、皱纹增多和色斑等“衰老”的表现。这种衰老现象不断地随着年龄的增长而加剧，直观地表现为面部出现皱纹和老人斑、皮肤发暗和失去光泽、皮肤粗糙和弹性变差、动脉血管硬化、眼球晶体出现老年性白内障、角膜透明度减小和胳膊腿不灵活甚至关节疼痛等现象。因此，胶原蛋白在医疗、护肤和保健品等领域具有广泛的应用。胶原蛋白的高效合成具有重要的市场价值。

胶原蛋白在合成过程中，需要通过脯氨酸和赖氨酸的羟基化来提高其稳定性和交联效果。胶原蛋白脯氨酸残基的羟基化对胶原蛋白的三螺旋结构的稳定至关重要。哺乳动物脯氨酰4-羟化酶(P4H)是一种具有α2β2四聚体排列的酶，是合成胶原的关键酶，对胶原蛋白链中脯氨酸残基的翻译后羟基化起作用。由于人脯氨酸4-羟化酶需要两个蛋白亚基组成四聚体，这使得胶原蛋白的体外和体内脯氨酸羟基化变得十分困难，这严重阻碍了胶原蛋白合成的进展。近年来，也有团队尝试使用小型病毒的脯氨酸羟化酶L593(Shi,J.,Ma,X.,Gao,Y.etal.Hydroxylation of Human Type III Collagen Alpha Chain byRecombinant Coexpression with aViral Prolyl 4-Hydroxylase in Escherichiacoli.Protein J 36,322–331(2017).https://doi.org/10.1007/s10930-017-9723-0)来实现胶原蛋白体内的羟基化。这种方法只需要表达或纯化L593单体即可实现人脯氨酸4-羟化酶四聚体的效果，因此极大地降低了胶原蛋白羟基化的难度。但是L593的在细胞中的表达极为困难，非常不利于胶原蛋白的合成。

发明内容

本发明公开了一种高表达高活性的脯氨酸羟基化酶L593m，其氨基酸序列如SEQID No.3所示；或者与SEQ ID No.3具有95％以上的同源性，且具有与SEQ ID No.3所示的脯氨酸羟基化酶L593m基本相同的酶活性。

本发明还公开了上述的脯氨酸羟基化酶L593m的编码基因。

优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还公开了上述的脯氨酸羟基化酶L593m的表达载体。

优选的，所述载体为pGEX-6P1。

本发明还公开了上述的脯氨酸羟基化酶L593m的表达宿主菌。

以及上述的脯氨酸羟基化酶L593m在催化胶原蛋白羟基化中的应用。