[发明专利]一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼及其构建方法

说明书

本发明公开了一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼及其构建方法，属于医药技术领域，本发明将血红蛋白通过点击化学的方法修饰到纳米颗粒表面，形成稳定且标准化的蛋白冠，从而减少了单核吞噬系统的摄取，延长了血液循环时间，增加了肿瘤相关巨噬细胞M2型细胞对蛋白纳米笼的摄取，从而提高了肿瘤靶向效率。本发明血红蛋白冠化的蛋白纳米笼，其血液半衰期t1(fast)从46.5min延长至56.0min，而t2(slow)从411.5min延长至645.4min。冠化血红蛋白明显延长了蛋白纳米笼的血液半衰期。本发明血红蛋白冠化的蛋白纳米笼有望用于肿瘤相关巨噬细胞M2型的再极化，从而推动蛋白纳米笼肿瘤免疫治疗的临床转化。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼及其构建方法。

背景技术

当静脉注射的纳米药物进入生理环境时会不可避免地与血液发生相互作用，从而赋予纳米药物新的生物界面，这一界面被称为纳米药物的蛋白冠。由于蛋白冠来源于机体本身，蛋白冠介导的靶向递送不仅会降低纳米药物的免疫原性和毒性，而且通过选择纳米递送系统的表面蛋白冠有望实现肿瘤个性化治疗。纳米递送载体的表面性质决定了蛋白冠的组分和数量，而蛋白冠又对外源纳米递送系统的活体行为、亚细胞分布、免疫应答和靶点富集有巨大影响。因此，蛋白冠于纳米递送系统是一把双刃剑，一方面纳米递送系统表面吸附“无益”血浆蛋白不仅会降低其肿瘤靶向性，而且会激活巨噬细胞，增加细胞因子的分泌。另一方面，吸附“有益”血浆蛋白，则可增加纳米递送系统的血液循环时间和生物安全性，甚至可增强靶点富集效率。例如纳米颗粒表面结合白蛋白会提高其在血液中的“隐藏”性能减缓药物系统清除从而增加血液循环时间和生物安全性，聚苯乙烯纳米颗粒表面结合凝聚素可以减少巨噬细胞的吞噬实现免疫逃逸，载脂蛋白E结合到脂质体纳米药物表面极大地增强了脑部肿瘤富集效率，Mishra等人也报道细菌结合玻连蛋白(VTN)可以“伪装”免疫系统，阻碍宿主先天性免疫补体级联的应答。所以，选择性的吸附“有益”蛋白冠不仅会减少单核吞噬系统对纳米药物的吞噬，延长纳米药物的血液循环时间，而且有望会提高肿瘤靶向性。

目前纳米药物蛋白冠化的方法主要是将纳米药物与血浆孵育，通过调节纳米颗粒的表面性质以动态吸附的方法制备生物分子冠化的纳米载体，然而，血红蛋白虽然在血浆中的丰度相对较高，大约是0.11mg/mL，但是传统吸附方法难以形成稳定和标准化的蛋白冠，因此可能会弱化蛋白冠介导的延长血液循环时间的能力。为此，本发明提供一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼及其构建方法。

发明内容

本发明提供了一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼及其构建方法，有效解决了传统的吸附方法难以形成稳定和标准化的蛋白冠，利用被动吸附的方法导致血浆蛋白冠化效率低和丰度低的问题，同时构建了一种减少巨噬细胞吞噬，延长血液循环时间，增加肿瘤靶向效率的纳米体系。

本发明提供了一种血红蛋白冠化的蛋白纳米笼的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将末端琥珀酰亚胺酯活化的叠氮-聚乙二烯连接子(N₃-PEGLinker)加入到蛋白纳米笼(PNC)溶液中，室温下，于160rpm振荡反应，通过氨基和琥珀酰亚胺的点击化学反应将N₃基团引入蛋白纳米笼表面，于4℃避光孵育，然后利用100kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的N₃-PEGLinker，得到蛋白纳米笼-叠氮(PNC-N₃)溶液；

将末端马来酰亚胺活化的环炔-聚乙二烯连接子加入到血红蛋白溶液中，于160rpm振荡反应2h，通过巯基和马来酰亚胺的点击化学反应将环炔基团修饰到血浆蛋白Hb上，然后利用100kDa的超滤管超滤换液PBS以除去游离的环炔-聚乙二烯连接子，得到血红蛋白-环炔；

S2，将S1的血红蛋白-环炔加入到S1的PNC-N₃溶液中，室温下，于160rpm避光振荡反应，得到血红蛋白冠化的蛋白纳米笼。