[发明专利]一种用于衣康酸检测的质粒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于衣康酸检测的质粒及其应用，所述质粒的结构为pACYC184‑STM3121‑AmCyan或pACYC184‑STM3121‑Nluc。本发明通过利用分子克隆的技术，以pACYC184质粒为载体，成功构建了可以体外定性检测衣康酸的pACYC184‑STM3121‑AmCyan绿色荧光蛋白报告基因质粒及pACYC184‑STM3121‑Nluc荧光素酶报告基因质粒，此方法成本小、方便快捷以及直观快速，为衣康酸的研究提供了有效的鉴定平台。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说，涉及一种用于衣康酸检测的质粒及其应用。

背景技术

衣康酸(甲叉琥珀酸，又称亚甲基丁二酸)是三羧酸循环(TCA)循环的衍生物，早期主要用于工业聚合物合成，1995年发现免疫反应基因1(Irg1)编码的IRG1(也称顺乌头酸脱羧酶，CAD)负责巨噬细胞中衣康酸的合成，近年的研究表明表明其具有免疫调节作用。除了免疫调节作用外，衣康酸还是一种抗菌代谢物，通过抑制细菌的异柠檬酸裂解酶(ICL)来限制细菌的生长。此外包括鼠疫耶尔森菌和铜绿假单胞菌等携带的基因，如ripA、ripB、ripC可编码降解衣康酸的酶，通过影响胞内衣康酸浓度，从而调控细菌的生物学功能，因此建立衣康酸定量方法是研究其调控功能的关键。

衣康酸作为一种抗菌代谢物在哺乳动物免疫细胞中积聚到毫摩尔级，并抑制乙醛酸循环中涉及的细菌异柠檬酸裂解酶(ICL)。乙醛酸分流仅存在于微生物中，对某些病原体的生长至关重要，但尚未在哺乳动物中发现。因此，靶向乙醛酸分流是抗生素化合物的一个很有前途的靶点。衣康酸具有限制细菌生长的抗菌特性，包括结核分枝杆菌[8]、沙门氏菌和军团菌。此外，包括马立克氏病、甲型流感和寨卡病毒在内的病毒感染可诱导哺乳动物顺乌头酸脱羧酶表达，这表明衣康酸也可能具有抗病毒特性。衣康酸的解毒是致病菌的抗性机制，是趋同进化的结果。衣康酸盐被证明是免疫和炎症的重要调节剂，它是M1型巨噬细胞炎症激活过程中高度上调的代谢物之一。由脂多糖(LPS)、病毒成分或干扰素γ(IFN-γ)激活的M1巨噬细胞表达高水平的基因Irg1，编码乌头酸脱羧酶(CAD)。该酶以TCA循环中间体顺乌头酸为底物，将其转化为衣康酸，从而使衣康酸在细胞内积累。这些结果表明，衣康酸可以由细菌的LPS等外膜抗原对巨噬细胞的刺激而产生，并且由于细菌的外膜抗原不同，引起巨噬细胞产生的免疫反应程度不同，可能导致产生不同水平的衣康酸，提示衣康酸可以作为细菌感染导致细胞损伤的潜在指标的可能性。

衣康酸的重要应用提示我们急需建立衣康酸的检测方法，来帮助我们研究其发挥调控作用的原理与途径，而目前对于衣康酸的检测方法仅有质谱和传统的碘还原法或酸碱滴定法，本研究建立了一种衣康酸响应的报告质粒，用于衣康酸的便捷、快速检测。目前检测衣康酸的方法主要是通过质谱，但质谱检测存在价格昂贵、维修费用高、检测灵敏度存在差异等不足。其次是通过传统方法碘还原法或酸碱滴定法检测衣康酸，但该方法存在干扰因素多，结果不准确，无法定量低浓度衣康酸等缺点。因此，建立一种简便、快捷的衣康酸检测方法，是研究其调控作用的关键。

鼠伤寒沙门菌LT2株的毒力岛包含衣康酸应答操纵子(IRO)基因(STM3117至STM3120)，该操纵子的启动子(PIRO)由衣康酸特异性诱导，且需STM3121编码LysR家族转录调节因子RipR的参与。因此，本研究构建一种衣康酸检测质粒，通过RipR和衣康酸调控绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶的表达，初步建立能够定性、定量检测衣康酸含量的方法，为外源性或内源性衣康酸的检测和功能研究提供技术支撑。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种用于衣康酸检测的质粒及其应用。为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于衣康酸检测的质粒，所述质粒的结构为