[发明专利]一种表达鸡传染性贫血病病毒VP1蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法

说明书

本发明涉及一种表达鸡传染性贫血病病毒VP1蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法,属于基因工程技术领域。本发明的关键技术是在血清4型禽腺病毒中寻找到合适的位置插入外源基因；同时利用CRISPR‑Cas9技术在血清4型禽腺病毒中插入鸡传染性贫血病病毒VP1基因以及带有LoxP位点的RFP表达盒，利用RFP蛋白进行病毒的纯化，纯化完成后使用Cre重组酶敲除RFP表达盒，最后获得可以稳定表达鸡传染性贫血病病毒VP1蛋白的重组血清4型禽腺病毒。本发明构建的表达鸡传染性贫血病病毒VP1蛋白的重组血清4型禽腺病毒，为血清4型禽腺病毒和鸡传染性贫血病病毒的联防联控提供了二联候选疫苗。因此，本发明具有良好的市场应用价值。

技术领域

本发明涉及一种表达鸡传染性贫血病病毒VP1蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，具体涉及一种利用CRISPR-Cas9和Cre-LoxP重组系统构建的表达鸡传染性贫血病病毒VP1蛋白的重组血清4型禽腺病毒，属于基因工程技术领域。

背景技术

鸡传染性贫血病病毒(Chicken Infectious Anemia Virus，CIAV)属指环病毒科(Anelloviridae)圆圈病毒属(Gyrovirus)。CIAV感染主要引起以雏鸡障碍性贫血及全身性淋巴组织萎缩为特征的免疫抑制，同时伴随着对其他病原(如病毒、细菌、真菌)易感性的增加。该病在2-4周的鸡群开始发病，1-7日龄雏鸡对该病易感性最高，死亡率一般在10-20％，偶尔可达60％，亚临床感染也可造成重大损失。自1979年Yuasa等首次分离到Gifu-1毒株以来，目前呈世界范围流行。我国于1992年首次在黑龙江省分离到CIAV。近年来，由于缺乏有效的防控策略，CIAV的流行与感染给我国养鸡业带来了严重的经济损失。此外，近几年高致病性血清4型禽腺病毒(FAdV-4)导致的肝炎-心包积液综合征在国内鸡群尤为流行，同样极大的威胁着养禽业的健康持续发展。然而，目前市场上尚无针对CIAV和FAdV-4的二联疫苗。本发明以FAdV-4为病毒载体，通过CRISPR/Cas9技术和Cre-loxP重组系统，靶向Fiber-2，利用双荧光体系成功构建了表达CIAV病毒T1P6毒株VP1蛋白的重组FAdV-4病毒FAdV4-VP1(CIAV)，为CIAV和FAdV-4的有效联防联控提供了技术支撑和疫苗候选。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有的不足，提供一种表达鸡传染性贫血病病毒VP1蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，基于CRISPR-Cas9技术构建表达鸡传染性贫血病病毒VP1蛋白的重组血清4型禽腺病毒。本发明的关键技术是在血清4型禽腺病毒中寻找到合适的位置插入外源基因；同时利用CRISPR-Cas9技术在血清4型禽腺病毒中插入鸡传染性贫血病病毒VP1基因以及带有LoxP位点的RFP表达盒，利用RFP蛋白进行病毒的纯化，纯化完成后使用Cre重组酶敲除RFP表达盒，最后获得可以稳定表达鸡传染性贫血病病毒VP1蛋白的重组血清4型禽腺病毒。

本发明的目的是这样实现的：一种基于CRISPR-Cas9技术的表达鸡传染性贫血病病毒T1P6毒株VP1蛋白的重组血清4型禽腺病毒，其特征是：

所述鸡传染性贫血病病毒T1P6毒株VP1蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示。

重组血清4型禽腺病毒，其中使用鸡传染性贫血病病毒T1P6毒株VP1基因替换FAdV-4的Fiber-2基因，替换的是FAdV-4的Fiber-2基因的253位核苷酸到1440位核苷酸，FAdV-4的Fiber-2基因序列如SEQ ID NO.2所示。

重组血清4型禽腺病毒的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)利用sgRNA在线设计网站设计针对血清4型禽腺病毒Fiber-2基因的sgRNA，其序列如表1所示：

表1针对Fiber-2基因的sgRNA序列