[发明专利]一种提取动物乳汁中乳脂球RNA的方法

权利要求书

1.一种提取动物乳汁中乳脂球RNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：取泌乳期动物的乳汁，装入含有DEPC原液的离心管中，所述DEPC原液与乳汁的体积比为1:1000，将离心管底部放入液氮中冷却5-10秒，快速抽离，上下剧烈摇晃，使其温度快速下降，重复以上操作，待离心管中的乳汁出现少量冰晶后，停止操作；

步骤二：将上述离心管放入4°C离心机中离心，参数设置为12000r/min、10min；

步骤三：离心后将离心管转移至-20°C冰箱中，冷冻5min；

步骤四：将上述冷冻后的离心管在超净台上分离出600-800μg 乳脂，置入已提前预冷并加入600μL Trizol的离心管中，并且上下剧烈摇晃，冰浴静置5min；在冰浴过程中每隔1min上下剧烈摇晃一次；冰浴完成后放入4°C离心机中离心，参数设置12000r/min、10min；观察到Trizol上层还有一层透明的油脂层，移除该油脂层；

步骤五：将300μL提前预冷好的氯仿加入上述已分离去除油脂层的离心管中，冰浴静置5min，在冰浴过程中每隔1min上下剧烈摇晃一次；然后放入4°C离心机中离心，参数设置12000r/min、15min；

步骤六：取上述离心管中的上清液，加入到另一管新的离心管中，并且加入与上清液体积比为1：1的预冷好的异丙醇；上下轻柔的摇晃几次，冰浴8min，在冰浴过程中每隔2min上下轻柔的摇晃一次；然后放入4°C离心机中离心，参数设置10000r/min、10min；

步骤七：移除上述离心管中的上清液，加已预冷好的1mL 75%乙醇冲洗沉淀部分，冰浴1min；然后放入4°C离心机中离心，参数设置8000r/min、4min；

步骤八：移除上述离心管中的上清液，大风吹，待沉淀由白色变成周围透明中间乳白色，停止大风吹，加入15-80μL的DEPC水，用移液枪吹打混匀则完成乳脂球RNA的提取。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水均提前放入-20°C预冷。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤中移除上清液应使用已剪过枪头的移液枪进行操作。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述75%乙醇为无水乙醇与DEPC水以体积比为3：1的比例进行配置，现配现用，提前预冷10min以上。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述DEPC水的配方为：DEPC原液与三蒸水体积比为1：1000，分装至无菌无RNA酶离心管中，混匀。