[发明专利]一种明胶微球载体及其应用

说明书

本申请公开了一种明胶微球载体及其应用，以明胶为主体，制成水溶液，加入柠檬酸调节pH至酸性可抑制交联剂京尼平的反应，再加入京尼平为交联剂，通过滴注进入液氮冷冻一步成型，再与碳酸氢钠反应将pH调节至碱性，促进京尼平进行交联固化，得到明胶微球载体。本申请的明胶微球载体制备工艺简单，稳定性强利于储藏、且制备成本低，对细胞无害、能有效负载细胞并扩增细胞，可用于细胞3D培养。

技术领域

本申请涉及生物医药材料技术领域，具体而言，涉及一种明胶微球载体及其应用。

背景技术

与传统的平面细胞培养技术相比，三维细胞培养技术能够较为真实地模拟生物体内细胞的存活环境，更逼真的还原出细胞间相互作用和生理生化反应，以及细胞对内源性和外源性刺激如温度、pH、转运和分化等方面的改变所作出的实际应答。3D细胞培养可以用于构建类器官模型或是肿瘤模型，以更为准确贴合的方式进行如药物的代谢动力学研究、药效评估以及更加直观的细胞生物学方面的研究，使得3D细胞培养成为必不可少的研究工具。

目前，以明胶作为细胞负载基质或是制成球型载体是当前3D细胞培养的研究热点。明胶是动物胶原蛋白部分水解后的主要产物，具有良好的生物降解性、生物相容性、无毒性、亲水性和非免疫原性等生物特性，在药品、食品、组织工程、农业领域都是广泛应用的功能性生物高分子材料。

明胶微球的制备技术较为成熟，目前有乳化交联、溶剂挥发、喷雾干燥和相分离等多种制备方法。大部分方法都是通过油相和水相乳化搅拌剪切成球，再使用交联剂如甲醛、戊二醛固化成明胶微球。也有使用其他交联剂进行反应的，如CN109793717A公开了一种明胶微球的制备方法与应用，以明胶水溶液为水相，石蜡为油相乳化搅拌成球经过冷冻后，再由京尼平进行交联。或者是通过微流控制芯片成型的方法，如CN110200922B公开了一种明胶微球的制备方法及应用，以明胶水溶液为水相，油为油相经过微流控装置成液滴进入收集相，然后在4-12℃下成胶，最后使用京尼平进行交联。这两个制备方法所使用的交联剂京尼平是一种植物天然交联剂，可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料，其毒性远低于戊二醛和其他常用化学交联剂，但是这两个制备方法在微球成型过程中需要使用油相。再如CN112250892A先将明胶溶液进行喷雾干燥或是喷雾冻干处理获得微球前体，微球前体再于不良溶剂如甲醇、丙酮及乙腈等溶剂或水溶液中进行交联固化，但是CN112250892A在固定阶段使用有机溶剂固化或有机溶剂进行保护球体形状，在成球后必须设法除去使得清洗步骤较为麻烦，加大成本。也有未使用交联剂进行固化微球的，如CN112266487A是以壳聚糖为骨架固定明胶，将壳聚糖明胶溶液冷冻喷雾处理，再于赋形剂如糖、葡聚糖、明胶、甘露醇等保护下冻干处理得到微球，但是该方法需要喷雾干燥以及多次冷冻干燥处理，制备过程复杂时间较长，涉及不同设备的使用，加大成本。因此，需要提供一种制备过程简单安全，绿色环保且不伤害细胞的活性，能够有利于干细胞贴附以及扩增，且节省成本方便大规模生产的微球的制备方法。

发明内容

本发明提供了一种一种明胶微球载体，采用如下方法制备：

步骤一，取明胶溶于温水中，搅拌均匀，得到明胶水溶液；

步骤二，将柠檬酸加入步骤一制备的明胶水溶液调节pH≤3，溶解拌匀，得到柠檬酸明胶溶液；使用柠檬酸调节明胶水溶液的pH≤3可以抑制交联剂的反应活性，延长明胶、柠檬酸和京尼平混合溶液的使用时间。

步骤三，将京尼平粉末加入到步骤二制备的柠檬酸明胶溶液，溶解拌匀，制成明胶混合溶液；

步骤四，将步骤三制备的明胶混合溶液滴注至液氮中，凝固成型，得到明胶微球；

步骤五，将步骤四制备的明胶微球放入碳酸氢钠溶液中，反应3h或待球体变为浅蓝色提示反应完成后，用水洗净获得明胶微球载体。

进一步的，所述的明胶微球载体的制备方法还包括如下(1)-(7)中的一项或多项：

(1)每升所述明胶水溶液中明胶的添加量为50-300g；