[发明专利]一种外泌体激活NK细胞的培养方法

权利要求书

1.一种外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.K562细胞培养：将基因修饰过的K562-IL21工程细胞，用DMEM/F12培养基+5％胎牛血清进行细胞的扩增培养，2～3天传代一次；

S2.K562细胞促外泌体分泌：将步骤S1扩增后的K562细胞按1～2*10⁶/ml的密度至T75瓶，接着添加促外泌体分泌营养液进行培养，2～3天收集一次上清液，同时再次补充同等量的促外泌体分泌营养液，继续收集上清，共收集2次，得上清液；

S3.K562细胞外泌体提取与纯化：采用PEG6000溶液对步骤S2制得的上清液进行外泌体纯化处理，得K562外泌体；

S4.NK细胞活化、扩增培养：从外周血或脐血中分离出单个核细胞，接着加入步骤S3制得的K562外泌体活化培养0～7天，然后扩增培养7～14天，即得。

2.如权利要求1所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中的促外泌体分泌营养液由DMEM/F12培养基、人血小板衍生生长因子BB、促红细胞生成素和γ干扰素混合组成。

3.如权利要求2所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中的促外泌体分泌营养液由15mL DMEM/F12培养基、10ng/mL人血小板衍生生长因子BB、20mg/mL促红细胞生成素和20mg/mLγ干扰素混合组成。

4.如权利要求1所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S3中K562细胞外泌体提取与纯化的具体步骤为：

将步骤S2制得的上清液在速度为2000g的条件下离心30min，弃沉淀，得过滤液，接着加入乙酸调pH至4～5，加入浓度为24％(m/v)的PEG6000溶液，放4℃冰箱沉降过夜，次日离心，弃上清，生理盐水重悬沉淀，接着加入浓度为15％(m/v)的PEG6000溶液二次沉降，再次离心，沉降的产物用生理盐水重悬，即得。

5.如权利要求4所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述24％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:1进行添加，所述15％(m/v)的PEG6000溶液与过滤液按体积比1:50进行添加。

6.如权利要求1所述的外泌体激活NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S4中NK细胞活化、扩增培养的具体步骤为：

A.单个核细胞的分离：

a.将外周血或脐血转移至50mL离心管，1000g离心10min，吸出上层血浆，放56℃水浴灭火30min，下层血液加等体积生理盐水重悬；

b.灭火的血浆降温至4℃，经1200g离心10min，弃底部沉降物，上层血浆备用；

c.准备50mL离心管，加入淋巴细胞分离液12.5mL，再加入稀释重悬后的血液25mL，配平后600g离心30min，升降速调至最低；

d.离心后，吸取中间白膜层细胞，加生理盐水清洗两遍，期间取微量计数，接着再300g离心10min，获得单个核细胞；

B.活化培养：

a.培养瓶包被，T75瓶，加50ng/mL的CD16单抗和50ng/mL的CD3单抗，平铺底部，在37℃的条件下放置2h或4℃过夜；

b.用免疫细胞培养基配制活化培养基和增值培养基；

c.取出包被的培养瓶，倒掉包被液，用PBS清洗1遍，将步骤A制得的单个核细胞加入活化培养基重悬，根据细胞计数结果，调整密度在1.5～3*10⁶/mL，体积不大于20mL；

d.重悬的单个核细胞转入已包被的培养瓶，加入步骤S3制得的K562外泌体和10％的自体灭火血浆；

e.前2天静置培养，第3天，补加20mL活化培养基和5％自体灭火血浆，后面根据细胞增值情况，一般1～2天补液一次，第7天补液，同时添加步骤S3制得的K562外泌体，持续培养；

C.扩增培养：

待500mL活化培养基用完后，再补加增值培养基，控制补液后NK细胞密度不低于1*10⁶/mL，持续培养至14天，收集细胞，即得。