[发明专利]一种微小残留病灶ctDNA质控品及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种微小残留病灶ctDNA质控品，其特征在于，所述质控品包括38种细胞经酶切纯化所得的片段化DNA，所述各片段化DNA含有如下表所示的基因突变，所述各片段化DNA的质量份数如下表所示：

2.根据权利要求1所述的微小残留病灶ctDNA质控品，其特征在于，DNA-1～DNA-37所示的基因突变位点为肿瘤细胞自身携带的基因突变位点或通过基因编辑得到的基因突变位点。

3.根据权利要求2所述的微小残留病灶ctDNA质控品，其特征在于，DNA-1～DNA-37使用的细胞包括但不限于MDA-MB-134-VI、SNU-C1、SW1116、SW48、MDA-MB-468、MCF7、KATOIII、SW620、SK-LMS-1、A-253、SH-4、SNU-449、SW1088、SK-OV-3、A549、BXPC-3、NCI-H1975、NCI-N87、ME-180、RKO、HCT116、HEK293T、GM12878和KBM-7；DNA-38使用的细胞包括但不限于GM12878、KBM-7、HEK293A、HEK293T和HCT116。

4.根据权利要求1所述的质控品，其特征在于，所述DNA-1～DNA-38的片段化DNA主带大小为144bp-176bp。

5.根据权利要1～4任一项所述的微小残留病灶ctDNA质控品，其特征在于，所述各片段化DNA的质量份数如下表所示：

6.根据权利要求1-5任一项所述的微小残留病灶ctDNA质控品，其特征在于，所述质控品包含突变频率为0.5％的阳性质控品、突变频率为0.05％的阳性质控品、突变频率为0.005％的阳性质控品和阴性质控品；所述阴性质控品为不含DNA-1～DNA-37的基因突变位点的细胞经酶切纯化所得的片段化DNA。

7.一种微小残留病灶ctDNA质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：选择细胞进行基因编辑；具体包括如下步骤：

(1)针对目标基因的目标位点，设计特异的向导RNA；

(2)将向导RNA的表达载体和单链DNA共转染至目标细胞；

(3)进行单细胞克隆；

(4)细胞克隆形成后，进行sanger测序，确定基因编辑成功；

S2：Mnase酶切；

(1)使用Mnase酶对细胞核小体进行酶切，然后磁珠筛选纯化；

(2)纯度测定；

OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格；

OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格；

(3)DNA片段分布检测；

主带大小为144bp-176bp范围，判定合格；

S3：片段化DNA混合和稀释；

经酶切片段化和纯化所得的DNA，需按照权利要求1的质量份数进行混合，得到各基因突变靶点的基因突变频率为0.5％的阳性质控品；通过数字PCR验证突变位点变异信息；

通过对所述基因突变频率为0.5％的阳性质控品稀释10倍，获得基因突变频率为0.05％的阳性质控品，通过对所述基因突变频率为0.05％的阳性质控品稀释10倍，获得基因突变频率为0.005％的阳性质控品；DNA-38的细胞经酶切纯化所得的DNA片段，通过浓度调整后的产物即为阴性质控品；数字PCR测定基因突变频率，并计算基因突变频率比值；

S4：NGS测序验证。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述数字PCR验证突变位点变异信息如下：

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中进行多基因panel高深度测序，并对测序数据进行突变频率分析，检测的基因如下表所示：