[发明专利]昆虫RPA-LFD检测引物和探针以及检测方法

说明书

本发明公开了昆虫RPA‑LFD检测引物和探针以及检测方法。本发明以苹小吉丁幼虫DNA为模板，根据苹小吉丁的ITS1基因序列设计多对RPA引物进行扩增，通过比较筛选得到扩增效率最优的苹小吉丁RPA检测引物，为避免检测结果的假阳性，对筛选出的苹小吉丁RPA检测引物的反向引物和探针中引入少量错配碱基得到特异性苹小吉丁RPA‑LFD检测引物和探针并建立了苹小吉丁RPA‑LFD检测方法，实现野外准确快速鉴定苹小吉丁的目的；特异性和灵敏性检测结果表明，碱基错配后的引物对和探针能特异性扩增苹小吉丁，对于窄吉丁A以及窄吉丁B均不能扩增，检测限为DNA浓度为10supgt;‑2/supgt;ng/μL以上，具有较高的灵敏度。

技术领域

本发明涉及昆虫的检测引物和探针以及检测方法，尤其涉及苹小吉丁RPA-LFD检测引物和探针以及检测方法，属于苹小吉丁的分子检测领域。

背景技术

苹小吉丁Agrilus mali Matsumura(鞘翅目：吉丁甲科)是一种十分重要的枝干害虫，常常在中国北方苹果产区造成严重危害，引起苹果产量下降，带来重大经济损失，并在近年来，于中国新疆伊犁河谷野果林内暴发成灾，导致珍贵野生资源新疆野苹果Malussieversii(Ledeb.)Roem.大面积死亡。

目前，在苹小吉丁分子检测方面，主要运用线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因序列(≈650bp)比对分析方法，这种方法虽然成熟，但由于需要专门的仪器设备，同时要求操作人员具备相关的专业知识和使用生物信息学分析软件的能力，仅适应于在实验室条件下开展，无法满足基层一线相关人员调查及快速识别苹小吉丁的实际需求。

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase ploymerase amplication，RPA)是2006年由Piepenburg等发明的一种新型恒温(37～42℃)核酸扩增技术[Piepenburg O.,WillamsC.H.,Stemple D.L.,et al.DNA detection using recombination proteins[J].

PLoS Biol,2006,4(7):e204.DOI:10.1371/journal.pbio.0040204.]，该方法既可以扩增DNA也可以扩增RNA，省去了额外的cDNA合成步骤整个过程进行得非常快，一般可在10min内获得可检出水平的扩增产物[孙魁.基于RPA-LFD的核酸可视化检测技术的建立及应用[D].北京:解放军军事医学科学院,2017]。作为一项新的病原体检测技术，目前RPA-LFD尚未得到广泛研究。近年来，在人、畜、禽及水产动物上已有RPA-LFD研究报告，而在实验动物病原体检测方面的研究较少。目前，RPA-LFD的一个重要技术瓶颈是其引物和探针既没有明确的设计原则，也没有专业的设计软件。研究者通常需要手动设计不同的引物和探针(于灵芝.可视化核酸检测技术RPA-LFD的研究和应用进展.实验动物与比较医学.Dec.2021,41(6))。

探针长度以及探针相对于引物的最佳位置并没有固定的设计规则，这导致有很多种可能的组合，无疑会增加该方法中引物和探针合成及筛选的成本。因此，设计得到高特异性和灵敏度的引物和探针需要克服一定的技术障碍，才可使RPA-LFD检测方法的灵敏度和特异度得到保证。

发明内容

本发明的目的之一是提供昆虫RPA-LFD检测引物和探针；

本发明的目的之二是提供一种昆虫RPA-LFD检测试剂盒；

本发明的目的之三是提供一种苹小吉丁RPA-LFD检测方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了昆虫RPA-LFD检测引物和探针，其中，所述的昆虫RPA-LFD检测引物和探针选自以下第(1)组或者第(2)组中的中的任何一组检测引物和探针：