[发明专利]一种外切型褐藻胶裂解酶及其编码基因和应用在审
| 申请号： | 202310282165.1 | 申请日： | 2023-03-17 |
| 公开（公告）号： | CN116515804A | 公开（公告）日： | 2023-08-01 |
| 发明（设计）人： | 陈梅;李忠海;闫梦迪;孙飞;姚艳艳;常丽荣;杨晓斌 | 申请（专利权）人： | 齐鲁工业大学（山东省科学院）;威海长青海洋科技股份有限公司;荣成爱伦湾食品有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/88 | 分类号： | C12N9/88;C12N15/60;C12N1/21;C12N15/70;C12P19/02;C12R1/19 |
| 代理公司： | 山东竹森智壤知识产权代理有限公司 37382 | 代理人： | 刘文容 |
| 地址： | 250353 山东*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 外切 褐藻 裂解 及其 编码 基因 应用 | ||
1.一种外切型褐藻胶裂解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述的外切型褐藻胶裂解酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种重组载体，其特征在于，其含有权利要求2所述的一种编码外切型褐藻胶裂解酶的基因。
4.一种重组菌，其特征在于，其含有权利要求3所述的重组载体。
5.权利要求1所述的一种外切型褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，获取弧菌Vibrio furnissii C1的全基因组DNA作为模板，所述模板含褐藻胶裂解酶基因VAL1，所述褐藻胶裂解酶基因VAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
S2，设计并合成扩增褐藻胶裂解酶基因VAL1的引物，其引物序列如下：
上游引物VAL1F:5’GTACCATGGTGAAACACAACGTACTAGTAG-3’(NcoⅠ)；
下游引物VAL1R:5’GTACTCGAGCTTTCCGTTTAGCTTCAAC-3’(XhoⅠ)；
S3，PCR扩增及重组质粒的构建：采用S2中的引物以S1中的基因组DNA为模板进行扩增，PCR产物经限制性内切酶酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET28b上，将连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，筛选含有褐藻胶裂解酶基因VAL1的重组质粒，并进行测序验证；
S4，褐藻胶裂解酶的表达与纯化：将含有褐藻胶裂解酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，诱导褐藻胶裂解酶蛋白表达，并纯化，获得纯化后的褐藻胶裂解酶。
6.根据权利要求5所述的一种外切型褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征在于，所述S3中PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s；58℃退火15s；72℃延伸30s；72℃终延伸10min，30个循环。
7.根据权利要求5所述的一种外切型褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征在于，所述S4中蛋白的纯化方法为镍柱亲和层析纯化法。
8.权利要求1所述的一种外切型褐藻胶裂解酶的应用，其特征在于，可以用于褐藻单糖的生产。
9.根据权利要求8所述的一种外切型褐藻胶裂解酶的应用，其特征在于，所述褐藻单糖的生产条件为：pH为6.5～8.0，温度为20～30℃。
10.根据权利要求8所述的一种外切型褐藻胶裂解酶的应用，其特征在于，所述褐藻单糖的生产条件为：pH为7.0，温度为25℃。
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