[发明专利]特异性识别唾液酸化路易斯酸x的ssDNA适配体及其应用

权利要求书

1.一种特异性识别唾液酸化路易斯酸x的ssDNA适配体，其特征在于，所述ssDNA适配体的核苷酸序列为Apt1，Apt2或Apt16；

Apt1：

5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGAAAAATAAATTAATAAGCAATTTTATTTTTATCCTAGCCACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；

Apt2：

5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGAGTTAAATAAATTACCCCAATTTATTTATTTCCATTTCGACCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；

Apt16：

5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATGATGGCAAAATATTAATTCCTGAACTGCGATTTAATATTTTCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′。

2.根据权利要求1所述的一种特异性识别唾液酸化路易斯酸x的ssDNA适配体，其特征在于，ssDNA适配体的3′端或5′端修饰有功能基团或分子。

3.一种如权利要求1所述的ssDNA适配体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、通过PCR扩增初始ssDNA文库，正向引物用羧基荧光素FAM标记，反向引物用生物素Biotin修饰，形成含羧基荧光素FAM和生物素Biotin标记的dsDNA产物；

ssDNA文库中的序列在结构上均符合下述通式所示的结构特征：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′，其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N40代表长度为40个核苷酸的随机片段，

正向引物的核苷酸序列为：

5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3′，

反向引物的核苷酸序列为：

5′-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′，

正向引物和反向引物的其中一条修饰荧光基团，另一条修饰生物素Biotin；

S2、将PCR扩增后获得的dsDNA通过链霉亲和素和生物素Biotin相互作用固定在链霉亲和素修饰的磁珠MB表面，形成dsDNA文库固定后的MB；

S3、当dsDNA文库固定的MB与靶标孵育时，用羧基荧光素FAM标记的对靶标具有高亲和力的ssDNA序列从MB上的dsDNA文库中脱落；通过测定磁性分离后上清液中FAM的荧光强度，可以判断其筛选效果，将上清液中的ssDNA收集起来，作为PCR扩增的模板，生成二级dsDNA文库，用于下一轮筛选；

S4、将S3步骤获得的次级dsDNA文库多次重复S2与S3步骤操作，通过检测荧光信号强度变化判断需要的重复次数，直至最后一轮PCR扩增后进行测序；

S5、从S4步骤获得的测序结果中筛选出对SLe^x具有高亲和力和高特异性的序列，得到特异性识别SLe^x的ssDNA适配体。

4.一种权利要求1-2任意一项所述的ssDNA适配体在检测唾液酸化路易斯x(SLe^x)中的应用。

5.一种可用于唾液酸化路易斯酸x检测的组合物、试剂盒、传感器或芯片，其特征在于：包括权利要求1所述的ssDNA适配体中的一种或多种。

6.一种用于检测唾液酸化路易斯酸x的荧光生物传感器，其特征在于:包括权利要求1所述的ssDNA适配体中的一种或多种，还包括与获得的适配体进行的适配体Bio-dots的合成，量子点为Bio-dots。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:采用所述荧光生物传感器检测SLe^x时包括以下步骤：

S1、选取权利要求1所述的单链DNA适配体中的一种或多种，用于适配体Bio-dots的合成，进一步构建生物传感器；

S2、将3-氨基苯硼酸(3-APBA)通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)羧基活化剂修饰在羧基化MB上；其次利用硼酸盐与SLe^x特异性结合的能力将靶标SLe^x结合到3-APBA修饰的MB上；

S3、然后将结合有靶标SLe^x的3-APBA修饰的MB与适配体SLe^x-Apt2 Bio-dot孵育通过磁性分离，将未结合的适配体SLe^x-Apt2 Bio-dot分离出来；

S4、检测磁性分离后上清的荧光强度变化，构建荧光强度与SLe^x浓度的标准曲线，计算得到待测样品中SLe^x的含量。