[发明专利]一种重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：以来源于Proteusmirabilis的L-氨基酸脱氨酶基因为模板，将该酶命名为PM473，以pET-20b为载体，重组转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中获得重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET20b-PM473基因工程菌。

2.一种重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：以来源于Proteusmirabilis的L-氨基酸脱氨酶基因GeneBank:MG746627.1为模板，将该酶命名为PM473，以SalI-XhoI为克隆位点将PM473插入到pET-20b载体中，通过PCR扩增技术，得到重组表达质粒pET20b-PM473，将重组表达质粒pET20b-PM473转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，经过氨苄青霉素抗性筛选、酶切、菌液PCR和SDS-PAGE验证后获得重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET20b-PM473基因工程菌。

3.一种L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂，其特征在于：所述全细胞催化剂为权利要求1所述的重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌的全细胞菌体。

4.一种L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，培养得到种子液，将种子液中加入到含有氨苄青霉素抗性的TB培养基中进行培养、诱导产酶，将诱导发酵后的菌悬液离心，使用Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液振荡清洗，再次离心后得到L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞菌体，即为L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂，将所述全细胞菌体保存于上述Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中。

5.根据权利要求4所述的一种L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂的制备方法，其特征在于：

所述基因工程菌按体积分数0.5％～1％的接种量接种到含有100～200μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，转速200～250r/min，在30～40℃下培养10～14小时；

所述种子液按体积分数0.5％～1％接种量接种到含有100～200μg/ml氨苄青霉素的TB培养基中，放置于30～40℃下摇床培养；

当加入新的TB培养基中富集培养的菌液OD₆₀₀在1.6～2.0时，加入0.05～0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，15～25℃范围内诱导发酵10～14小时；

所述离心的温度为4～30℃，转速为8000～10000r/min，时间为10～15min；

所述Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液的pH为6.0～8.0，浓度为0.01～0.05mol/L。

6.一种α-酮酸的制备方法，其特征在于：以氨基酸为底物，利用权利要求3所述的L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂进行催化脱氨生成相应的α-酮酸。

7.根据权利要求6所述的一种α-酮酸的制备方法，其特征在于：所述氨基酸为混旋谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-苏氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸中的一种，分别得到α-酮戊二胺酸、丙酮酸、2-酮基3-羟基丁酸、苯丙酮酸、2-酮基-3-巯基丙酸。

8.根据权利要求6所述的一种α-酮酸的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：以氨基酸为底物，利用Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液溶解底物，加入L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂进行反应，取出反应液后使酶失活，然后离心，离心后保留上清反应液弃去沉淀，所述上清反应液即为α-酮戊二胺酸。