[发明专利]一种纯化HER2单链抗体的方法

说明书

本发明公开了一种纯化HER2单链抗体(scFv)的方法，所述方法通过SPY Cather蛋白与SPY Tag多肽间的特异性结合，经过PT Linker‑SPY Cather重组蛋白修饰的环氧载体，用以捕获scFv‑Mxe GyrA‑EGFP‑SPY Tag重组蛋白，并通过单因素试验与响应面法优化出最优的反应条件提高了该载体的吸附效率，最后利用二硫苏糖醇(DTT)使Mxe GyrA内含肽发生N端断裂，一步法释放出单链抗体(scFv)，所述HER2单链抗体保持活性不变。本发明简化单链抗体纯化的操作流程、一步洗脱与标签切除、提供了一种无蛋白液相纯化仪与纯化柱也可纯化蛋白的方法，不仅适用于单链抗体的纯化、也适用于其他多种蛋白质的纯化，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于蛋白表达技术领域，具体涉及一种快速的纯化HER2单链抗体(HER2-scfv)的方法。

背景技术

乳腺癌目前已成为女性诊断和死亡率高的恶性肿瘤。其中大约25-30％的乳腺癌患者存在人类表皮生长因子受体(HER2)过度表达，近年来随着靶向治疗的发展，针对HER2为治疗靶点的抗体偶联药物已成为当下的研究热点。

单链抗体(scFv)相对分子质量小，更容易穿透组织到达靶部位，使肿瘤周围达到有效的血药浓度；由于缺少Fc段，scFv并不具备完整抗体的效应功能从而导致免疫原性降低，不易引起人体排斥和超敏反应；scFv在体内清除速度快，减少了全抗分子带来的心脏、肝、肾等重要器官的损伤。因此，scFv逐渐成为了基因工程抗体的研究热点之一。

蛋白质内含肽(intein)是前体未成熟蛋白质中的一段多肽链，可通过蛋白质自我剪接作用实现蛋白质结构的重新排列。Mxe GryA是蟾分枝杆菌Mycobacterium xenopiGryA中198Aa组成的微小型内含肽，将其C端剪接结构模块中的天冬氨酸突变为丙氨酸后可阻断内含肽C端的剪接反应，但在其N末端半胱氨酸处仍然可发生N-S酰基重排形成硫酯键，可通过添加硫醇试剂如二硫苏糖醇(DTT)来控制硫酯键的断裂。

SPY Cather与SPY Tag是来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的纤连结合蛋白(FbaB)第二个免疫球样胶原黏附蛋白结构域(CnaB2)的两个可通过异肽键结合的蛋白。SPY Cather与SPY Tag可以在各种不同的条件下(pH、温度、缓冲液组分)可迅速形成稳固的异肽键且不容易发生断裂。

单链抗体因与质粒、标签构建简便且在重组质粒可在大肠杆菌中成功表达，有利于发挥其免疫诊断、治疗作用。大肠杆菌作为传统生物学表达系统之一，易于培养、遗传背景清晰是表达外原蛋白的首选表达系统。但目前单链抗体在表达纯化方面仍然存在上清表达量较低、沉淀表达操作复杂、纯化步骤繁琐等问题。实现单链抗体的可溶性表达、简化蛋白纯化过程，对后续单链抗体的研究及治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种一步法纯化单链抗体的方式，所述方法通过SPYCather与SPY Tag之间的特异性捕获scFv，再利用二硫苏糖醇(DTT)使Mxe GyrA内含肽发生N端断裂纯化scFv，从而实现无需仪器与纯化柱的一步分离纯化单链抗体的新方法。

本发明的目的可通过以下技术实现。

本发明的的第一个方面，提供了一种用于修饰环氧载体的PT Linker-SPY Cather重组蛋白，所述重组蛋白由多肽片段PT Linker和SPY Cather蛋白组成，所述PT Linker-SPY Cather重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的的第二个方面，提供了一种scFv-Mxe GyrA-SPY Tag重组蛋白，所述重组蛋白由单链抗体(scFv)、内含肽(Mxe GyrA)及多肽片段SPY Tag组成，所述scFv-Mxe GyrA-EGFP-SPY Tag重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。