[发明专利]一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母及其制备疫苗应用

权利要求书

1.一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母，其特征在于：所述的重组酵母为转化了pYD1-G重组质粒的酿酒酵母，命名为EBY100/pYD1-G，所述的pYD1-G重组质粒能在酵母表面展示系统表达MSRV-G蛋白，所述的MSRV-G蛋白的基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母，其特征在于：所述的酿酒酵母是Saccharomyces cerevisiae EBY100。

3.根据权利要求1所述的一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母，其特征在于：所述的pYD1-G重组质粒pYD1-G能融合表达MSRV-G蛋白基因片段与凝集素受体Aga2亚基；所述的Aga2亚基以C-末端与G蛋白融合，所述的酵母与凝集素受体Aga1亚基连接，所述的Aga1亚基与所述的pYD1-G重组质粒连接。

4.一种权利要求1所述的表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)MSRV-G的克隆与扩增；

(2)重组质粒pYD1-G的构建；

(3)重组酵母EBY100/pYD1-G的分子构建。

5.根据权利要求4所述的一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母的制备方法，其特征在于步骤(1)具体为：根据MSRV-G蛋白的基因片段分别设计引物，引物F-1和R-1中的酶切位点分别是BamH I和EcoR I，引物序列如下：

F-1：5’-CGGGATCCCGATGCATCTCGCTGCGAAAGA-3’，R-1：5’-GAATTCGAATGCGGACAGCACGTCTGATTC-3’；利用特异性引物进行MSRV-G的扩增，扩增体系为：MSRV-G cDNA 2.0μL、上游引物F-1 2.0μL、上游引物R-1 2.0μL、2×PrimeSTAR Max Premix25.0μL、ddH₂O 19.0μL，得到对PCR扩增产物进行纯化回收，得到SRV-G蛋白片段。

6.根据权利要求4所述的一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母的制备方法，其特征在于步骤(2)具体为：

A.表达质粒pYD1的提取

利用质粒提取试剂盒从DH5α/pYD1提取质粒，-20℃保存，待用；

B.PCR产物及pYD1质粒双酶切及胶回收

利用BamH I、EcoR I对纯化的PCR产物与pYD1质粒进行双酶切，反应体系如下：10×QuickCut buffer 5μL，BamH I 1μL，EcoR I 1μL，DNA0.2μL，ddH₂O补足50μL，30℃酶切5min，37℃酶切5min；再通过琼脂糖凝胶电泳检测并纯化，-20℃保存，待用；

C.MSRV-G与pYD1载体的连接与转化

利用T4 DNALigase将酶切后的MSRV-G序列插入到pYD1载体中，连接体系如下：10×ligation buffer 2μL、T4 DNALigase 1μL、pYD1载体DNA1μL、纯化的PCR产物5μL、灭菌水11μL，总体系20μL，4℃连接过夜，得到重组质粒pYD1-G。

7.根据权利要求4所述的一种表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母的制备方法，其特征在于步骤(3)具体为：利用质粒提取试剂盒提取重组质粒pYD1-G；将重组质粒pYD1-G的电转化至EBY100感受态细胞，经阳性克隆的筛选鉴定得到重组酵母EBY100/pYD1-G。

8.一种权利要求1所述的表达大口黑鲈弹状病毒G蛋白的重组酵母在制备大口黑鲈弹状病毒疫苗中的应用。