[发明专利]一种特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体及其应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种特异性识别β‑乳球蛋白的优化适配体及其应用。该优化适配体由β‑乳球蛋白原始适配体Lg‑18经优化后得到，所述β‑乳球蛋白原始适配体Lg‑18的序列如SEQ ID NO：1所示，所述优化的方式包括剪裁、碱基突变和结构优化。本发明以β‑乳球蛋白为靶标，在SELEX筛选获得的原始序列基础上，结合剪裁、碱基突变以及结构强化等手段，获得了能以高亲和力及特异性识别结合β‑乳球蛋白的优化适配体序列，该优化的适配体序列具有较高的结构稳定性，能有效降低适配体对应用环境体系的敏感性。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种特异性识别β-乳球蛋白的优化适配体及其应用。

背景技术

牛乳富含机体生长发育所必需的各种氨基酸及微量元素，素有“白色血液”之称，因此深受人们喜爱。但其作为联合国粮食及农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)划定的八大类过敏食物之一，由牛乳引发的牛乳过敏(CMA)已逐渐成为婴幼儿群体中最常见的食物过敏反应，严重影响着婴幼儿群体的身体健康，甚至危及生命。近年来由于生活方式的改变、微生物的暴露、饮食习惯的改变等多种因素，婴幼儿的肠道免疫功能越来越低，婴幼儿牛乳过敏发生率正呈逐年上升的趋势。据调查表明，约82％左右牛乳过敏群体的致敏原为β-乳球蛋白(β-Lg)，因此β-乳球蛋白被认为是牛乳中最主要的过敏原蛋白，可以看作为牛乳过敏原监测的标志物。因此，对食物过敏原β-乳球蛋白准确检测既可以为生产者评估食物潜在致敏性风险提供重要依据，又可以为牛乳过敏群体的日常饮食提供有效指导。

目前食物过敏原β-乳球蛋白常用的检测方法包括色谱分析技术、基于识别特征基因的分子生物学技术和基于抗原-抗体特异性识别酶联免疫分析方法(ELISA)等，虽然，色谱分析技术(尤其LC-MS技术)因具有准确度高、特异性强、线性范围宽等优点，但是样品前处理复杂，需要昂贵仪器设备和专门的技术人员，制约了该技术的普及与推广。分子生物学方法是一种间接检测方法，依赖检测特异性序列，需要筛选针对性的过敏原标志基因，而且并非每个过敏原都有合适的标志基因可被应用到实际样本的检测。另外食品加工的复杂处理过程可能会导致核酸降解，最终影响检测结果。ELISA法虽有良好的特异性、准确性及较高的灵敏度的优点，但是制备特异性抗体过程仍然繁琐且耗时，且制备出的抗体稳定性差，不易进行化学修饰，大大限制了过敏原β-乳球蛋白检测方案的开发与应用。

适配体(aptamer)是通过指数富集配体进化技术(SELEX)从人工合成的随机核苷酸文库中筛选获得能特异性结合靶物质的单链寡核苷酸。适配体在特定微环境体系内可形成特定的三维构象(发卡、假结、凸环和G-四联体等)，通过空间结构的匹配、氢键、范德华力和静电相互作用等分子间相互作用力与靶物质进行高亲和性结合。与抗体相比具有很多优势：(1)人工合成，不依赖动物体内免疫，批次之间的差异小；(2)稳定性好，可长期保存，耐热性强；(3)亲和力高，特异性强，适配体Kd可低至纳摩尔级别，能很好的区分结构类似物；(4)易于修饰，适配体两端标记化学基团(如FAM、ROX、FITC和生物素等)不影响其亲和性。因此，适配体作为一种新型的识别分子在医疗诊断、环境监测和食品安全分析等领域具有无可比拟的优势，且已被整合开发各类生物传感/分析平台。

一般情况下，通过SELEX技术直接筛选到的适配体含有70～130个核苷酸，包含两端引物区和中间随机序列区。但并不是所有的核苷酸都参与适配体与靶标的结合过程，非必需核苷酸序列区可能会形成各种二级结构从而干扰适配体与靶标的结合或者降低适配体-靶标复合物的构象稳定性，且较长的序列会带来较低的产率和较高的合成成本。因此，实际使用中对适配体的序列进行剪裁优化，在保留适配体亲和性能的前提下，获得适配体最短序列大有裨益。此外，因其核酸的化学本性，适配体构象具有固有灵活性，本质上是动态的，并且具有包含相互转换子状态的巨大构象合集。这种过度灵活的构象通常会导致结合亲和力减弱、脱靶相互作用以及对应用场景的高度敏感性，从而严重影响适配体在实际应用中的性能。因此，亟需对适配体采取一定的结构强化策略，以努力提高适配体构象稳定性，降低其结合性能对环境的敏感度，促进适配体的应用与发展。

发明内容