[发明专利]一种基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基及其应用

权利要求书

1.一种基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基，其特征在于，包括以下组分：

基础培养基、HEPES缓冲液、青霉素链霉素溶液、支原体去除试剂、营养添加剂和特异性因子；所述营养添加剂为GlutaMAX添加剂和B27添加剂；所述特异性因子为WNT-3a条件培养基、R-Spondin1条件培养基、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸、A83-01、EGF、Y-27632和Noggin。

2.根据权利要求1所述的基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基，其特征在于：所述支原体去除试剂为prophylactic。

3.根据权利要求1所述的基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基，其特征在于，所述WNT-3a条件培养基经过以下步骤制得：

S1：复苏一支L WNT 3A细胞，用筛选培养基培养P0，当P0细胞长至80％密度以上时，按1:10传代至P1；所述筛选培养基的组成为：DMEM+10％FBS+1％青霉素链霉素溶液+0.4mg/mLG-418溶液；

S2：使用生长培养基培养P1，当P1细胞生长至80％密度时，1:10传代至P2；所述生长培养基组成为：DMEM+10％FBS+1％青霉素链霉素溶液；

S3：使用收获培养基培养P2，4天后收集培养基，离心收集上清，作为WNT条件培养基一；再加入收获培养基培养3天，收集培养基并离心，收集上清作为WNT条件培养基二；将WNT条件培养基一和WNT条件培养基二按1:1的体积比混合，并用0.22μm的滤膜过滤，即得WNT-3a条件培养基；所述收获培养基的组成为：Advanced DMEM/F12+1％GlutaMAX+1％青霉素链霉素溶液+8％FBS+1％HEPES。

4.根据权利要求1所述的基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基，其特征在于，所述R-Spondin1条件培养基经过以下步骤制得：

S1：复苏一支HA-R-Spondin1-Fc-293T细胞，使用筛选培养基培养P0，当细胞密度达到80％左右时，P0按照1:10传代至P1；所述筛选培养基的组成为DMEM+10％FBS+1％青霉素链霉素溶液+300μg/mL Zeocin溶液；

S2：使用第一生长培养基培养P1，当P1细胞生长至80％密度时，1:10传代至P2；所述第一生长培养基培养的组成为DMEM+10％FBS+1％青霉素链霉素溶液；

S3：使用第二生长培养基培养P2，当细胞密度大于80％时，更换第二生长培养基为收获培养基，培养7天后收集上清并离心，用0.22μm滤膜过滤后即得R-Spondin1条件培养基；所述第二生长培养基的组成为：DMEM+10％FBS+1％青霉素链霉素溶液，所述收获培养基的组成为Advanced DMEM/F12+1％Glutamax+1％青霉素链霉素溶液+1％HEPES。

5.根据权利要求1所述的基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基，其特征在于：所述基础培养基为Advanced DMEM/F12。

6.根据权利要求1所述的基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基，其特征在于，所述培养基中各组分的浓度如下：

7.根据权利要求6所述的基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基，其特征在于，所述培养基中各组分的浓度如下：

8.权利要求1～7任一项所述的基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基在膀胱类器官模型构建中的应用，包括以下步骤：

S1：取动物膀胱组织，经机械及酶解消化后过滤离心，保留细胞沉淀，去除红细胞，得细胞悬液。

S2：将细胞悬液重悬于基质胶中，接种、固定；然后置于基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基中培养，每3～4天观察换液，每7～12天进行传代；所述基质胶为Matrigel基质胶。

9.权利要求1～7任一项所述的基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基在膀胱癌类器官模型构建中的应用，包括以下步骤：

S1：取动物膀胱癌组织，经机械及酶解消化后过滤离心，保留细胞沉淀，去除红细胞，得细胞悬液。

S2：将细胞悬液重悬于基质胶中，接种、固定；然后置于基于上皮干细胞的膀胱或膀胱癌类器官的培养基中培养，每3～4天观察换液，每7～12天进行传代；所述基质胶为Matrigel基质胶。