[发明专利]一种白僵菌素的发酵培养方法

说明书

本发明提供了一种提高白僵菌素发酵产量的方法，采用如下组成的基础发酵培养基：包含50‑100g/L的碳源，10‑30g/L氮源，5‑25g/L的无机盐，并且在发酵培养的0h‑120h内，向基础发酵培养基或发酵液中添加一定量的L‑苯丙氨酸或缬氨酸。本发明方法可大幅提高白僵菌素的产量，白僵菌素的发酵水平最高达到2100µg/ml以上，并且工艺简便稳定，适合工业化生产。

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种白僵菌素的发酵培养方法。

背景技术

白僵菌素(Beauvericin，BEA)作为绿色微生物源农药，具有专一性强，不对非标靶生物产生危害、无污染、不易产生抗药性、又与环境相容的优势，而广泛应用于较大规模森林，小型草坪花园的除菌剂、除草剂和杀虫剂。同时白僵菌素还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等许多生物活性，它在癌症、病毒和细菌感染等致命疾病中的潜在用途，越来越多的应用于人类医药中，具有广阔的市场前景。

白僵菌素最早是由白僵菌分离得到虫生真菌的次生代谢产物，它是一种六元环状三缩肽化合物，分子结构中包含3个N-甲基苯丙氨酸和（D）-α-羟基异戊酸通过肽键和酯健交错相连而成，分子式为C₄₅H₅₇N₃O₉, 分子量为786。

目前发现的白僵菌素大多是由白僵菌属和镰刀菌属产生，而利用镰刀菌生产白僵菌素的报道多采用固体发酵，但固态发酵存在以下不足：（1）操作繁琐，发酵周期长，如CN105087726A公开的固体发酵周期长达20天；（2）培养基中的水分蒸发难以控制，从而使产量波动较大；（3）存在基质混合困难，代谢物无法实时检测，不便于将来大生产中的自控操作。而液态培养条件下的发酵水平普遍较低，中国农业大学在2008年的《Enhancedbeauvericin production with in situ adsorption in mycelial liquid culture ofFusarium redolensDzf2》中报道的白僵菌素液体发酵单位为400.24µg/ml；李蔚在2012年发表的《抗真菌药物白僵菌素液体深层发酵与调控》中的镰刀菌在50L发酵罐中的液体发酵单位也只有488.24 µg/ml；专利CN.2013107251576公开的白僵菌素的发酵单位为400µg/ml左右；孙安徽在2016年的《白僵菌素在构巢曲霉中异源表达的研究》中，通过构巢曲霉中异源表达白僵菌素合成酶和ａ－酮异戊酸还原酶获得的白僵菌素产量最高668.97µg/ml。

到目前为止，报道的白僵菌素发酵单位都无重大突破，因此急需一种高产量的发酵培养基和发酵方法，以满足产业化生产的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种白僵菌素的发酵培养方法，能够显著提高白僵菌素发酵单位，同时简单可行，适合产业化。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种白僵菌素的发酵培养方法：将可育镰刀菌 fusarium proliferatum菌株经过培养得种子液，再将种子液接种到基础发酵培养基中进行液体发酵培养，发酵周期7天，在发酵0-120h，向基础发酵培养基或发酵液中加入1-10g/L的 L-苯丙氨酸或0.8-8g/L的缬氨酸。所述基础发酵培养基为不包含L-苯丙氨酸或缬氨酸的培养基部分。 所述基础发酵培养基包含：50-100g/L的碳源，10-30g/L氮源，5-25g/L的无机盐；所述碳源为葡萄糖、麦芽糊精或其组合，所述氮源为蛋白胨，所述无机盐包括磷酸二氢钾、硝酸钠和碳酸钙。

所述基础发酵培养基的组成可以为：葡萄糖40-70g/L，麦芽糊精10-30g/L，蛋白胨10-30g/L，磷酸二氢钾5-15g/L，硝酸钠1-3g/L，碳酸钙1-4g/L。优选为：葡萄糖50g/L，麦芽糊精25g/L，蛋白胨20g/L，磷酸二氢钾10g/L，硝酸钠2g/L，碳酸钙3g/L。