[发明专利]一种高稳定性载体质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种高稳定性载体质粒及其构建方法和应用。该载体质粒的序列结构从5’端至3’端依次为：线性化位点的酶剪切点后序列‑启动子序列‑抗性基因序列‑第一过渡连接序列‑pUC复制起始位点序列‑第二过渡连接序列‑序列taa‑线性化位点的酶剪切点前序列。本发明载体质粒的稳定性高，克隆正确率高且产量高，长度较短能容纳更多的外源序列，尤其适用于Golden Gate克隆法。

技术领域

本发明涉及一种高稳定性载体质粒，该质粒的构建方法，以及该质粒的应用，属于生物技术领域。

背景技术

当前质粒在细胞基因治疗领域被大量使用，其中腺相关病毒包装、慢病毒包装、逆转录病毒包装以及mRNA制备需要使用的质粒的量非常大。然而在大规模制备质粒的过程中，质粒序列带来的毒性和不稳定的问题会导致大肠杆菌生长缓慢，质粒的丢失以及序列的改变，这些都会导致生产难度大大上升甚至生产失败。当前使用最多的载体质粒是以pUC57为代表的蓝白斑筛选质粒，这些质粒经过了常年科研方向的使用，而且当前仍然广泛应用，其成功是毋庸置疑的。然而，近年来新的合成技术层出不穷，最有代表性的是以Gibson Assembly为代表的重组法以及基于不对称限制性内切酶（Type IIS）的GoldenGate Assembly（Golden Gate克隆法），这些方法阳性率极高，因此不需要蓝白斑筛选，与之相比，上述蓝白斑筛选质粒的缺陷就显示出来，例如，包含BsaI、BbsI、BsmBI这些常见的不对称限制性内切酶，导致无法用于Golden Gate重组；需要使用IPTG和X-gal做筛选；此外，最严重的问题是其lac启动子会导致转录，使得包括多聚腺苷在内的序列都可能因为干扰转录或者翻译、以及合成毒蛋白，从而导致毒性。因此亟待研制出一种简化的、通用性强的、且不会引起上述转录的通用型载体质粒。

发明内容

本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种高稳定性载体质粒，克隆正确率高且产量高，长度较短能容纳更多的外源序列，尤其适用于Golden Gate克隆法；同时还提供相应的构建方法和应用，

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种高稳定性载体质粒，其特征是，所述载体质粒的序列结构从5’端至3’端依次为：线性化位点的酶剪切点后序列-启动子序列-抗性基因序列-第一过渡连接序列-pUC复制起始位点序列-第二过渡连接序列-序列taa-线性化位点的酶剪切点前序列；

所述线性化位点由酶剪切点前序列和酶剪切点后序列构成，酶剪切点指限制性内切酶剪切点；所述线性化位点为平末端位点。

优选地，所述线性化位点为PvuII位点、EcoRV位点、NruI位点、HpaI位点之一；PvuII位点序列为5’-CAG↑CTG-3’，EcoRV位点序列为5’-GAT↑ATC-3’，NruI位点序列为5’-TCG↑CGA-3’，HpaI位点序列为5’-GTT↑AAC-3’，其中↑表示酶剪切点。

优选地，所述启动子序列为SEQ ID NO.1；所述第一过渡连接序列为无或SEQ IDNO.2；所述pUC复制起始位点序列为SEQ ID NO.3；所述第二过渡连接序列为无或SEQ IDNO.4。

优选地，所述抗性基因序列为卡那霉素抗性基因序列SEQ ID NO.5、青霉素抗性基因序列SEQ ID NO.6、新霉素抗性基因序列SEQ ID NO.7、氯霉素抗性基因序列SEQ IDNO.8、壮观霉素抗性基因序列SEQ ID NO.9、庆大霉素抗性基因序列SEQ ID NO.10之一。

上述质粒是本发明针对Golden Gate克隆法，对现有pUC克隆载体质粒进行了优化后得到的，具体优化要点有：

1、在质粒中清除常见的限制性内切酶位点，尤其是BsaI、BbsI、BsmBI、BspQI和PaqCI这五个用于Golden Gate克隆法的位点，以及例如ClaI、NruI等，只保留一个线性化位点（具体为PvuII位点、EcoRV位点、NruI位点、HpaI位点之一），而这个线性化位点在克隆之后也可以被清除。