[发明专利]专一杀伤弧菌的抗菌蛋白、核酸分子、表达载体、宿主细胞、抗弧菌药物及应用

说明书

本申请提供一种专一杀伤弧菌的抗菌蛋白、核酸分子、表达载体、宿主细胞、抗弧菌药物及应用，涉及药物蛋白筛选鉴定技术领域。本申请提供的专一杀伤弧菌的抗菌蛋白TseV，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过实验证明TseV具有高效且专一杀伤弧菌微生物的特性，可以应用于临床治疗弧菌感染或治疗水产养殖业弧菌感染，可避免对宿主和宿主菌群产生负面影响，具有重要的社会价值和经济价值。

技术领域

本申请涉及药物蛋白筛选鉴定技术领域，尤其涉及专一杀伤弧菌的抗菌蛋白、核酸分子、表达载体、宿主细胞、抗弧菌药物及应用。

背景技术

细菌感染严重危害人类的生命健康，抗生素的使用给临床治疗或预防术后感染提供有效的技术手段，但抗生素的滥用已经对人类健康和生态环境构成威胁，引发了很多新的问题，如细菌产生耐药性、抗生素的毒性反应、菌群失调等负面影响。霍乱是一种由霍乱弧菌引发的甲类传染病，感染的严重患者可在数小时内死亡，当前对其治疗采用抗生素处理和补充电解质为主，挖掘新的抗菌药物替代部分抗生素的使用具有重要的科学价值。

发明内容

本申请的目的在于提供一种专一杀伤弧菌的抗菌蛋白、核酸分子、表达载体、宿主细胞、抗弧菌药物及应用，旨在解决现有霍乱弧菌普遍采用抗生素进行治疗，存在细菌产生耐药性、抗生素的毒性反应、菌群失调的问题。

为实现以上目的，本申请提供一种专一杀伤弧菌的抗菌蛋白，为如下(1)或(2)：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质为从不产霍乱毒素的霍乱弧菌菌株中鉴定得到的新的Ⅵ型分泌系统的效应蛋白-成孔效应蛋白TseV，其总的氨基酸残基为459个。

Ⅵ型分泌系统是一种微生物之间相互拮抗的新机器，其能将抗菌蛋白或抗真核生物蛋白注射到相邻的原核生物或真核生物使其中毒。Ⅵ型效应蛋白是Ⅵ型分泌系统的效应蛋白，通过Ⅵ型分泌系统进行分泌发挥功能。Ⅵ型分泌系统在霍乱弧菌中首次被发现以来，对其研究已经较为清楚。所有测序的霍乱弧菌都编码一套Ⅵ型分泌系统，这套系统由三个保守的基因簇(大簇、辅助1簇/辅助2簇)构成，每个簇上都编码一个抗菌效应蛋白。在产霍乱毒素的霍乱弧菌中，三个簇上效应蛋白是高度保守的，但在不产霍乱毒素的霍乱弧菌中这三个簇上编码的效应蛋白是复杂多样的。因此，本申请方案基于非产霍乱毒素的弧菌为研究对象，通过Ⅵ型分泌系统筛选鉴定得到新的抗菌蛋白。

成孔蛋白毒素(pore-forming toxin)是一类由病原微生物产生的细菌毒素，是细菌重要的毒力库。基于跨膜形式可分为α和β两个家族，C端有多个跨膜域，N端无信号序列。通过作用于细菌的膜，泄漏离子或大分子物质导致细菌或真核细胞死亡。常见的包括大肠杆菌素(colicin)、溶血素HlyA、霍乱弧菌细胞毒素等，这些毒素的毒性机理都需要特定的受体，比如细菌的内外膜、胆固醇、膜蛋白等。本申请方案的TseV是一种全新的效应蛋白，一系列生理生化实验证明TseV是一个泄漏钾离子的成孔蛋白毒素。

可以理解的是，为了使(1)的TseV蛋白便于纯化，可在SEQ ID NO.1的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上标签，例如可以为Poly-Arg，或Poly-His，或FLAG标签。上述(2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(2)中的蛋白质可通过将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，和/或缺失一个或几个氨基酸残基，和/或插入一个或几个氨基酸残基，且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

本申请还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述的专一杀伤弧菌的抗菌蛋白。其中，核酸分子可以是NDA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。