[发明专利]一种菌的定性检测方法

权利要求书

1.一种菌的定性检测方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）获得菌种数对数与Ct值的标准曲线，得到Ct值的上限值C1和下限值C2、菌种数的上限值N1和下限值N2；其中，C1和N2对应，C2和N1对应；r²≥0.98；

（2）将准确取样的待测液和阳性对照菌种液分别进行扩增培养，得到待测液扩增液和阳性对照菌种液扩增液，检测待测液扩增液的Ct值A和阳性对照菌种液扩增液的Ct值B；

将待测液扩增液的Ct值A和阳性对照菌种液扩增液的Ct值B分别与上限值C1和下限值C2进行比较：

当0B≤C1时，

若0A≤C1，结果呈阳性，该待测液中含有菌；

若AC1，结果呈阴性，该待测液中不含菌。

2.根据权利要求1所述的定性检测方法，其特征在于，阳性对照菌种液的制备方法包括：

（a）获得菌浓度和OD值的标准曲线，r²≥0.99；

（b）测定第一菌种母液或第一稀释液的OD值，使其符合步骤（a）标准曲线的范围值；第一稀释液为第一菌种母液多次稀释后得到；

（c）将符合范围值的第一菌种母液或第一稀释液进行10倍梯度稀释，得到阳性对照菌种液。

3.根据权利要求2所述的定性检测方法，其特征在于，步骤（c）中，10倍梯度稀释的稀释倍数为：(0.01~5)×10⁷；步骤（2）中准确取样的体积为150μL~250μL。

4.根据权利要求2所述的定性检测方法，其特征在于，菌包括细菌或真菌；

当菌为细菌时，步骤（c）中，10倍梯度稀释的稀释倍数为：(0.01~5)×10⁷；步骤（2）中准确取样的体积为150μL~250μL；

当菌为真菌时，步骤（c）中，10倍梯度稀释的稀释倍数为：(0.01~0.1)×10⁷；步骤（2）中准确取样的体积为150μL~250μL。

5.根据权利要求2所述的定性检测方法，其特征在于，步骤（b）还包括：

测定第一菌种母液的OD值是否符合步骤（a）标准曲线的范围值；如高于步骤（a）标准曲线的范围值，需进行多次稀释，得到第一稀释液，直至第一稀释液的OD值符合步骤（a）标准曲线的范围值；

将第一菌种母液或第一稀释液的OD值代入步骤（a）标准曲线，计算得到第一菌种母液或第一稀释液的理论浓度。

6.根据权利要求2所述的定性检测方法，其特征在于，步骤（c）还包括：

利用平皿涂布法，取样150μL~250μL的阳性对照菌种液，得到阳性对照菌种液的实际浓度；之后计算回收率，回收率的范围为80%~120%；

回收率=实际浓度/理论浓度=（阳性对照菌种液的实际浓度×稀释倍数/第一菌种母液或第一稀释液的理论浓度）×100%。

7.根据权利要求2所述的定性检测方法，其特征在于，步骤（a）标准曲线的绘制方法为：将菌种液进行梯度稀释，利用平皿涂布法，计算菌浓度；以菌浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制浓度-OD值的标准曲线。

8.根据权利要求1所述的定性检测方法，其特征在于，阳性对照菌种母液扩增培养后得到阳性对照菌种母液扩增液，扩增培养的倍数为n；待测液和阳性对照菌种母液的准确取样体积均为V；检测阳性对照菌种母液的浓度为c2；

将待测液扩增液的Ct值A和阳性对照菌种母液扩增液的Ct值B与上限值C1和下限值C2进行比较：

当0B≤C1时，

若B≤A≤C1，该待测液的浓度c1为：N2/nV≤c1≤c2；

若C2≤AB，该待测液的浓度c1为：c2c1≤N1/nV；

若AC2，该待测液的浓度c1为：c1N1/nV。