[发明专利]用于鉴别猪瘟病毒2型感染的单克隆抗体制备方法及应用

权利要求书

1.一种重组杆状病毒表达的CSFV 2型E2蛋白，其特征在于，该蛋白的编码区cDNA序列如SEQ ID NO.5所示。

2.权利要求1所述CSFV 2型E2蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以CSFV 2型毒株HZ08的cDNA为模板，用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的特异性引物扩增获得E2蛋白编码区cDNA序列；

(2)将E2蛋白编码区序列克隆于改造过的带有分泌信号肽(SP)的pFastBac^TMHTB载体上，获得重组质粒pFastBac^TMHTB-SP-E2HZ；将该重组质粒转座至E.coli DH10Bac感受态细胞，获得重组杆粒Bacmid-SP-E2HZ；

(3)将重组杆粒Bacmid-SP-E2HZ转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒；收获重组杆状病毒表达的CSFV 2型E2蛋白，简称为SP-E2HZ蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，选择BamHⅠ和HindⅢ作为目的基因插入位点，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物扩增pFastBac^TMHTB载体，线性化之后的载体带有分泌信号肽。

4.一种用于鉴别猪瘟病毒2型感染的单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体的重链可变区氨基酸cDNA序列如SEQ ID NO.6所示，轻链可变区氨基酸cDNA序列如SEQ ID NO.7所示。

5.权利要求4所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将权利要求1中所述SP-E2HZ蛋白经纯化处理后，施用于经CSFV 2型毒株HZ08全病毒免疫后的小鼠以实现混合免疫；

(2)利用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和混合免疫后小鼠的脾脏细胞，制备杂交瘤细胞株；经过筛选和亚克隆，获得能稳定分泌特异性抗体的单克隆细胞株；

(3)对所获单克隆抗体进行亚型测定、IFA鉴定、免疫印迹鉴定和表位鉴定，筛选出能够阻断ELISA体系的单克隆抗体。

6.一种用于检测2型CSFV感染血清抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

SP-E2HZ蛋白及其预包被的酶标板，100ng/孔；

样品稀释液；

阴性对照；

含有权利要求4所述单克隆抗体的培养液；

HRP标记的山羊抗小鼠IgG；

洗涤液：含10mM PBS和0.5％吐温20的0.5％PBST；

显色液：包括A液、B液的TMB底物；

终止液：2M H₂SO₄。

7.权利要求6所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将所有组分都恢复到室温18-25℃，其中的试剂通过涡旋混匀；

(2)将被检血清样本用样品稀释液按1:5稀释后，向培养板每孔加入50uL，设置复孔和阴性对照；37℃孵育1h或4℃孵育过夜后，0.5％PBST洗涤3次，每次5min，拍干；

(3)用样品稀释液按1:8000稀释单克隆抗体，每孔加入50uL，37℃孵育1h；0.5％PBST洗涤3次，每次5min，拍干；

(4)用样品稀释液按1:10000稀释HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔加入50uL，37℃孵育1h；0.5％PBST洗涤3次，每次5min，拍干；

(5)加入100uL现配的TMB显色液，A液和B液等体积混合；在避光、室温条件下放置10min，加完第1孔后即开始计时；

(6)在第10min时向每个反应孔内加入50uL的终止液以终止反应，加终止液的顺序需和加显色液的顺序一致；

(7)在450nm处测定样本的吸光度值；

(8)按如下公式计算被检血清样本的阻断率：

阻断率(％)＝(1–待检血清OD_450nm)/阴性血清OD_450nm；

(9)结果判定：

如果被检样品的阻断率大于或等于36％，判定为阳性，即血清中含有CSFV 2型毒株抗体；

如果被检样品的阻断率小于或等于29％，判定为阴性，即血清中不含有CSFV 2型毒株抗体；

如果被检样品的阻断率在29％～36％之间，则判定为可疑。