[发明专利]程序可控的蛋白质快速分泌释放系统及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种程序可控的蛋白质快速分泌释放PASS系统，包括临床批准药物调控的蛋白质快速分泌释放系统，蓝光调控的蛋白质快速分泌释放系统和识别蛋白抗原信号的蛋白质快速分泌释放系统。本发明所述PASS系统具有响应多种诱导物并通过直接调控蛋白质分泌而不是诱导蛋白质转录表达，实现对用户自定义的多种蛋白质快速释放的能力。本发明所述PASS系统可以快速、高效地调控目标蛋白质的分泌释放，具有正交性、无毒性、高效性、低的背景泄露以及快速诱导蛋白质快速分泌释放等特征，为基础研究、基因工程和再生医学领域提供人工可控的蛋白药物快速、瞬时蛋白快速递送技术平台，对治疗蛋白质分泌不足或损伤引起的疾病具有巨大的潜在应用价值。

技术领域

本发明涉及合成生物学和光遗传学等多学科交叉领域，具体涉及一种哺乳动物细胞临床批准药物、蛋白抗原、蓝光诱导蛋白质快速释放系统的构建方法，以及其在哺乳动物基因工程及疾病治疗中的应用。

背景技术

蛋白的表达分泌参与调节哺乳动物的各种生命活动，包括细胞的增殖、分化、执行正确的生理学功能以及哺乳动物机体的生长和正常发育。蛋白的表达和分泌过程受损往往会伴随多种疾病的发生，严重影响人类健康的高发型代谢综合症如糖尿病、高血脂、高尿酸等疾病均与蛋白分泌不足或分泌过程受损相关。分泌蛋白作为治疗药物通常通过注射方式来递送，很难达到药物治疗窗口浓度或者提供合适的药物动力学。基因治疗和细胞治疗是递送治疗分泌蛋白常用方法，蛋白药物可以在基因转染的体细胞或外部移植的细胞中长期稳定表达。但是，安全有效的基因和细胞治疗需要按需精准调控蛋白药物的表达，持续性过度表达蛋白药物不利于安全有效治疗。为了实现可控的基因治疗，一些基于基因转录层次的抗生素调控转基因表达系统被设计开发。最典型的四环素和雷帕霉素调控基因表达开关被用于调控各种治疗蛋白表达。但这类调控系统的一个共同特征是蛋白质诱导表达和衰减发生在天的时间尺度上，无法在分钟或小时的时间尺度内进行蛋白表达释放调控。

随着合成生物学的发展，越来越多的基于合成生物学思想设计组装的基因线路被开发出来并用于精准可控的基因治疗和细胞治疗。尤其是装载有合成基因线路的人工定制细胞，可根据实际需求定制设计，感知用户自定义的输入信号，并对信号进行识别处理，随后输出相应的蛋白治疗药物，从而实现对疾病的精准治疗。然而，现有的人工定制细胞药物的表达释放大多基于对蛋白的诱导表达调控，对外界信号的分析、处理、输出存在延迟，诱导蛋白质的释放速度缓慢。通常情况下，该类定制细胞受到诱导信号刺激后，在4-6小时后才表达释放一定量的蛋白，在24-48小时达到诱导表达高峰。这种基于转录调控水平的可控开关系统由于调控蛋白表达释放需要较长时间，因此用于疾病治疗起效较慢。然而，对于许多疾病如哮喘、过敏反应、急性心梗、心绞痛、脑出血、癫痫、高血压等，快速释放治疗药物进行及时治疗至关重要。因此，如何设计、构建精准可控的蛋白药物快速释放控制系统，及时响应外界信号并在分钟级别快速释放治疗蛋白，实现按需快速给药是基因治疗和细胞治疗领域面临的一大挑战。

精准调控蛋白质的分泌对疾病治疗具有重要意义。正常生理状态下，细胞对外界信号的响应、分析以及处理往往十分迅速。多种蛋白酶、激素、杀伤蛋白以及神经递质等生物活性物质通常是经过转录翻译后储存于细胞内，当受到外界刺激后快速分泌于胞外并发挥特定的生物学功能。例如，血糖升高会刺激胰岛细胞迅速释放储存于胞内的胰岛素，在短时间内实现降血糖的效果；储存在心肌细胞内的心房钠尿肽(atrial natriureticpeptide，ANP)在心房压力升高时迅速释放从而实现血压稳态的维持；此外，免疫细胞对肿瘤细胞的识别及响应也十分迅速，当免疫细胞(NK细胞或T细胞)识别肿瘤后，储存在细胞毒性颗粒中的穿孔素和颗粒酶会迅速释放，诱导肿瘤细胞凋亡。