[发明专利]一种生物合成普伦斯特中间体的方法

权利要求书

1.一种生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮的方法，其特征在于，所述方法为：以硝基苯还原酶nbzA、羟胺苯变异酶habA、葡萄糖脱氢酶GDH为催化剂并构成酶混合系统，以葡萄糖和间硝基苯乙酮3NAP为底物，合成3-氨基-2-羟基苯乙酮3AHAP；

所述酶混合系统中硝基苯还原酶nbzA、羟胺苯变异酶habA、葡萄糖脱氢酶GDH的摩尔比为(1～4)：(1～8)：(1～32)。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的反应过程为：硝基苯还原酶nbzA催化间硝基苯乙酮3NAP生成3-羟基氨基乙酰苯3HAAP；羟胺苯变异酶habA催化3-羟基氨基乙酰苯3HAAP生成3-氨基-2-羟基苯乙酮3AHAP；葡萄糖脱氢酶GDH催化葡萄糖生成NADPH。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应体系中底物间硝基苯乙酮3NAP的浓度为2～10g/L。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硝基苯还原酶nbzA以硝基苯还原酶nbzA基因工程菌发酵培养的湿菌体破碎后以粗酶液形式加入，所述硝基苯还原酶nbzA基因工程菌是核苷酸序列SEQ ID NO.1所示的硝基苯还原酶nbzA基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到；

所述羟胺苯变异酶habA以羟胺苯变异酶habA基因工程菌发酵培养的湿菌体破碎后以粗酶液形式加入，所述羟胺苯变异酶habA基因工程菌是核苷酸序列SEQ ID NO.2所示的羟胺苯变异酶habA基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到；

所述葡萄糖脱氢酶GDH以葡萄糖脱氢酶GDH基因工程菌发酵培养的湿菌体破碎后以粗酶液形式加入，所述葡萄糖脱氢酶GDH基因工程菌是核苷酸序列SEQ ID NO.3所示的葡萄糖脱氢酶GDH基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羟胺苯变异酶habA以羟胺苯变异酶habA基因工程菌发酵培养的湿菌体破碎后以粗酶液形式加入，所述羟胺苯变异酶habA基因工程菌是核苷酸序列SEQ ID NO.23～27所示的羟胺苯变异酶habA基因插入重组表达载体后转入宿主菌中转化制备得到。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，对所述羟胺苯变异酶habA核苷酸序列SEQ IDNO.2中的RBS序列SEQ ID NO.7进行优化，优化后的RBS序列为SEQ ID NO.8～12中的任意一种；将所述优化后的RBS序列通过对应的引物SEQ ID NO.13～22置换至所述羟胺苯变异酶habA核苷酸序列中；得到核苷酸序列SEQ ID NO.23～27所示的含有优化后RBS序列的羟胺苯变异酶habA基因。

7.如权利要求4或5任一所述的方法，其特征在于，所述湿菌体按如下方法获得：将基因工程菌接入含卡那霉素的LB培养基中，35～37℃培养至OD600达到0.8，向发酵液中加入终浓度0.5～1mM的诱导剂IPTG，于28～30℃诱导培养，将获得的发酵液离心，收集菌体沉淀，即得所述湿菌体。

8.一种硝基苯还原酶nbzA在生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮中的应用，其特征在于，所述硝基苯还原酶nbzA的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

9.一种羟胺苯变异酶habA在生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮中的应用，其特征在于，所述羟胺苯变异酶habA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

10.一种葡萄糖脱氢酶GDH在生物合成3-氨基-2-羟基苯乙酮中的应用，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶GDH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。