[发明专利]基于微流控显微荧光的藻细胞密度和活体细胞密度检测方法与装置

说明书

本发明提供一种基于微流控显微荧光的藻细胞密度和活体细胞密度检测方法及装置，让微流控管道中藻细胞单个匀速经过显微视野，通过检测细胞荧光强度随所处位置变化呈现出的荧光峰数量实现浮游藻细胞精确计数，通过检测藻细胞可变荧光反演获得细胞活性，实现藻类活体细胞精确计数，通过记录特定体积样品藻类细胞数和活体细胞数计算出样品中藻类细胞密度和活体细胞密度。据此，设计了基于微流控显微荧光的藻细胞密度装置，该装置利用微流控实现样品定量进样，利用落射式显微荧光光路结合积分放大电路和高速采集电路，实现单藻细胞荧光和可变荧光测量，结合发明中提出的藻类细胞密度和活体细胞密度检测方法，实现藻类细胞密度和活体细胞密度检测。

技术领域

本发明属于植物学、环境科学领域，具体涉及一种基于微流控显微荧光的藻细胞密度和活体细胞密度检测方法与装置。

背景技术

浮游藻类是水生态系统中重要的初级生产者，也是水体生态健康的指示剂。通过对浮游藻类细胞密度检测，尤其是活藻细胞密度检测，可直接有效的反应其生长状态，对水质状况监测、藻华灾害预警等具有重要的科学和应用价值。

目前浮游藻细胞密度检测方法可分为直接法和间接法，间接法主要包括分光光度法、高效液相色谱法以及荧光检测法等，这些方法都是通过对叶绿素a浓度的测量反演出藻细胞密度，但国内外已有学者证明，叶绿素a易受藻细胞生长状态、种类以及体积等因素的影响，无法精准的反映藻细胞密度。直接法主要包括显微镜检法、库尔特计数法以及流式荧光细胞计数法等，显微镜检法是通过人工的方式在显微镜下进行观察记录，辨别藻细胞活性时，需要通过染色的方法对活藻细胞数进行检测，工作强度大，效率低，存在较大的人为影响因素，误差较大。库尔特计数法是将悬浮藻溶液通过小孔，在小孔两边设置电极，检测藻细胞通过时电阻的变化进行粒径检测和计数，该方法无法判断藻细胞的活性，并且易受其他悬浮物的影响，实际水体藻细胞计数测量准确率低。流式细胞荧光法通过激光诱导藻细胞产生荧光，检测微通道管中的单细胞荧光进行计数。这种方法工作效率高，具有快速准确的优点，但传统流式荧光法为提高检测的精准度，采用鞘液聚焦的进样方式保证单个细胞通过检测窗口，该方式首先需要对待测得悬浮液进行加压处理，然后通过喷嘴注入鞘液中，最后由加压的鞘液驱动藻细胞流经检测窗口，这就导致该进样结构非常复杂且需要消耗大量鞘液，同时流式细胞荧光法为获得多种参数，光路通常采用正交结构，该结构必须保证激发光路和荧光收集光路的垂直，使用前需要使用荧光小球进行繁琐对焦，无法适用于小型化的现场快速测量。另外在浮游活体细胞计数时需要进行染色复杂的前处理过程，且染色存在污染环境的风险因素，目前还无法适用于小型化的现场快速测量。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于微流控显微荧光的浮游藻类细胞密度和活体细胞密度检测方法与装置，藻细胞在微流控管道中匀速经过显微视野，通过测量分析单个藻细胞的荧光和可变荧光实现浮游藻细胞数和活体细胞数快速精准检测，通过记录特定体积样品的藻类细胞数和活体细胞数即可计算出样品中藻类细胞密度和活体细胞密度。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于微流控显微荧光的浮游藻细胞密度检测方法，采用落射式的激发发射光学结构，微流控管道中单个藻细胞匀速经过显微视野，单个藻细胞受激发射荧光强度随所处位置变化呈现出荧光峰形，通过检测荧光峰数量实现浮游藻细胞精确计数，通过记录特定体积样品的藻类细胞数计算出样品中藻类细胞密度。

进一步地，所述浮游藻细胞精确计数包括如下步骤：

步骤①藻细胞进入显微视野边缘，荧光信号开始产生但较微弱；随着藻细胞流向显微视野中心，荧光信号强度逐渐上升；

步骤②当藻细胞到达显微视野中心时，荧光信号强度达到峰值；

步骤③当藻细胞经过中心直到离开显微视野，荧光信号逐渐减弱直到消失；

步骤④通过检测细胞荧光强度随所处位置变化呈现出的荧光峰数量实现浮游藻细胞精确计数，通过记录特定体积样品的藻细胞数计算出样品中藻类细胞密度。