[发明专利]一种塑料降解酶突变体、含其的融合蛋白及其应用

说明书

本发明涉及蛋白质工程技术领域，提供了一种塑料降解酶突变体、含其的融合蛋白及其应用，所述突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型塑料降解酶相比，包含以下位点的氨基酸取代：第122位、第186位和第241位；融合蛋白包括所述突变体以及李氏木霉碳水化合物结合结构域。本发明的突变体及含其的融合蛋白，性能优良，显著增强了与底物结合能力，具有高效的塑料降解能力；稳定性好，在不同的条件下均能保持相当的活性，其可适应20‑70℃和pH＝3‑11的条件，最适pH为中性，最适温度为50℃。

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种塑料降解酶突变体、含其的融合蛋白及其应用。

背景技术

塑料是以单体为原料，通过加聚或缩聚反应聚合而成的高分子化合物，其抗形变由合成树脂及填料、增塑剂、稳定剂、润滑剂、色料等添加剂组成，主要成分是树脂。主要包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚氨酯(PU)、聚乳酸(PLA)和聚羟基脂肪酸酯(PHA)等。其中PET是由对苯二甲酸和乙二醇酯通过酯键连接而成的高分子化合物，主要用于饮料瓶等包装材料。

塑料垃圾的大量堆积带来了一系列的环境问题，据统计每年有数十万海洋哺乳动物及海龟和数百万只海鸟死于塑料污染，给海洋生态系统带来了极大的威胁，其中PET塑料占全球聚合物总量的18％。目前PET塑料废弃物的处理方式主要包括：物理法、化学法及生物催化法。其中物理法和化学法只能实现PET塑料的降级回收，得到的单体物质纯度较低，且仅能使得9％左右的PET塑料得到回收利用，其余塑料仍然是填埋或焚烧。而且物理法和化学法回收塑料都需要严苛的反应条件，这不仅提高了回收成本而且还会产生其他额外的污染物，对环境造成二次污染。相比之下，生物催化法回收PET塑料具有条件温和、绿色环保可持续等优点。该方法能够获得纯度极高的单体物质，经回收后仍然能够合成与其来源塑料具有相同性质的产品。

塑料的生物回收法主要依赖微生物体内的降解酶系，2012年日本大阪大学的学者于堆肥宏基因组中发现了一种塑料降解酶叶枝堆肥角质酶，该角质酶能够将PET塑料分解为对苯二甲酸酯和乙二醇，但是其降解效率缓慢。2016年日本学者发现了一种能够“吃”塑料的细菌，并将其命名为I.Sakaiensis，该细菌能够以PET塑料作为唯一碳源和能源，利用PET为底物进行生长繁殖，该菌体能够吸附在塑料表面分泌PET水解酶，在有水的参与下将PET分解为单体对苯二甲酸乙二醇酯，该单体通过细胞膜进入细胞质然后由MHETase分解为对苯二甲酸和乙二醇，二者能够进入该菌体代谢网络进一步分解为二氧化碳、甲烷和水等小分子无害物质，实现塑料的完全降解。

中国专利申请202211188452.8公开了一种嗜吡啶红球菌PET降解酶及其编码基因与应用，该申请提供的嗜吡啶红球菌PET降解酶PET Esterase对底物PET塑料、BHET和MHET均具有催化活性。该申请还提供了一种嗜吡啶红球菌P23的应用，嗜吡啶红球菌PET降解酶为单跨膜蛋白展示在所述嗜吡啶红球菌P23的细胞膜表面，通过繁殖培养嗜吡啶红球菌P23获得细胞膜表面展示嗜吡啶红球菌PET降解酶的菌体细胞，所述菌体细胞应用于催化降解PET塑料获得降解产物对苯二甲酸和对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯、催化对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯产生对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯或在酸性条件下催化对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯产生对苯二甲酸。

中国专利申请202110651807.1公开了一种菌酶联合降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法，该申请提供的方法为：以变栖克雷伯氏菌SY1(Klebsiella variicola SY1)经扩大培养获得的细胞悬液和南极假丝酵母角质酶为催化剂，以聚对苯二甲酸乙二醇酯为底物，以pH 7.0-9.0的缓冲液为反应介质构成反应体系进行降解反应，降解反应过程中，底物和南极假丝酵母角质酶先加入缓冲液中，60℃降解反应5天后，再加入变栖克雷伯氏菌SY1细胞悬液，30℃降解1天后升温至60℃继续降解5天，使聚对苯二甲酸乙二醇酯高聚物降解为单体化合物。

目前发现的塑料降解酶普遍存在降解效率低，稳定性差、表达量低，与PET底物结合能力有限等缺点。